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脂质体制备技术课件,脂 质 体 技 术 及 应 用,脂质体制备技术课件,Chapter :脂质体制备技术 第一节:概述 脂质体(Liposomes)最初由Eng.学者Bargham和Standrsh将磷脂 分散在水中,进行电镜观察时发现的。他们发现磷脂分散在水中自 然形成多层囊泡,每层均为脂质的双分子层,囊泡中央和各层之间 被水隔开,双分子层厚度约为4nm。 一、脂质体定义 系指将药物包封于类脂质双分子层内形成的微型泡囊(veside) 二、目前研究状况 目前主要集中在三个领域:1)膜模拟 2)药物的控释与靶向 3)体外细胞的生物大分子转移 在应用上:1988年,U.S.A 第一个脂质体药物进入临床试验, 至目前已有10家公司向FDA申请了14个此类药物,已获准临床试验, 已有部分产品上市。如:TLC公司的阿霉素脂质体,顺铂脂质体, 施贵宝与TLC合作的两性霉素脂质体,还有正完霉素,柔红霉素脂 质体,etc,还有空白脂质体上市,在服用或使用前加药物振摇即可 应用。,脂质体制备技术课件,目前脂质体在生物技术,免疫调节,遗传工程,etc各领域之间 相互渗透,特别在生物医学领域中将会有更大突破。 由于脂质体药物的治疗指数高,并能降低药物毒性和减少副作用,减少药物剂量,因此在药学领域将会有广泛的应用。 第二节:脂质体的作用特点 脂质体(Liposome)是一种定向药物载体,属于靶向给药系统(trageting drug delivery system)的一种新剂型,它具有类细胞结构,进入体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能,并改变药物在体内的分布,使药物主要在肝,脾,肺,骨髓等组织器官中聚积,从而提高其治疗指数。 一、脂质体剂型的特点 1、制剂工艺简单,一般药物都较容易包封 2、水溶性和脂溶性药物可包裹于同一脂质中,药物的包封率主 要与药物本身的脂-水分配系数有关,与膜材性质有关。 3、在体内使药物具有靶向性特征。 4、药物在脂质体中,以非共价键结合。,脂质体制备技术课件,5、能降低药物的消除速率,增加稳定性。 6、可制备多种用途的剂型,eg:注射,口服,局部给药etc 7、靶向性,主要进入网状内皮系统和血单核细胞,进入细胞间质少 8、毒性降低,药效增强。药物消除率降低,增加药物体内稳定性。 (前体药物应用时应考虑的因素) 二、脂质体的靶向性 (一)被动靶向性(天然靶向性) 这是脂质体静脉给药的基本特征,是由于脂质体进入体内即被 巨噬细胞作为异物处理。一般的脂质体主要被肝,脾中网状细胞 (phagocytic cells)吞噬,是治疗肝寄生虫,利什曼病等网状内皮系统 疾病的理想药物载体。特别在治疗肝,脾肿瘤,防止肿瘤转移,扩 散具有广阔的前景。 肌内或皮下注射及腹腔注射后,首先进入局部淋巴系统中,对 淋巴系统疾病的治疗,也有很好的靶向作用。 (二)物理和化学靶向性 此种靶向性是设计中利用某种物理性因素或化学因素的改变, 如局部的PH值,温度(病变部位)的改变而明显改变脂质体膜的通,脂质体制备技术课件,透性引起脂质体,选择性释放药物。For example: 温敏感脂质体(temperature-sensitive liposome),它使用具有 一定的相变温度的脂质混合物作为膜材或使用相变温度为41-42C 的合成磷脂为膜材,在热疗机对肿瘤局部的作用下,当脂质体药 物进入肿瘤的毛细管床时,脂质体达到液晶态相变温度,导致脂 质体迅速完全地释放药物,使血管内外的药物浓度迅速达到平衡, 这种脂质体的物理靶向性不需要脂质体离开毛细血管。Eg:3H-TMX (标记甲氨蝶呤)在局部升温的肿瘤区的摄起量可增大10倍以上, 并抑制肿瘤生长。 PH敏感脂质体:利用某些弱离子性药物包封在脂质体中,当 其进入体内,在肿瘤的低PH局部或区域,可以选择性地释放药物。 (三)转移靶向性 这种靶向性是采用预先封闭或减少网状内皮系统的摄取,然 后再给药物脂质体。For example:先用胶体粒子阻断网状内皮系 统的吞噬作用或先注射空白脂质体,使肝,脾摄取脂质体呈饱和 状态,然后再给药物脂质体以增加非网状内皮系统的摄取。,脂质体制备技术课件,(四)主动靶向性 这种靶向性是在脂质体上联接一种识别分子,即配体,通过 配体特异性专一地与靶细胞表面的互补分子相互作用,而使脂质 体在靶区释放药物。 多糖(或糖蛋白) 植物凝血素 配体 肽类激素 抗原,小半抗原 抗体(单克隆抗体) For example:放线菌素D脂质体-IgM型单克隆抗体治疗CH3/He小鼠 乳腺癌,显示出比单纯使用放线菌素D高得多的抗癌效果。有人将 癌细胞移植于小鼠腹腔内,次日注射该脂质体,给药剂量是游离剂 量的1/10以下,结果完全治愈。 三、脂质体的长效作用 选择脂质体的组分和类型直接与药物释放有关,一方面,药物 释放出脂质体是缓慢进行的,另一方面,还可设计不同半衰期的脂 质体,作为长效药物的载体。,脂质体制备技术课件,For example:Rahman采用阿霉素和阿霉素脂质体作药动学试验,剂 量6mg/ug,静注。 血药浓度峰值 1h后的血药浓度 t1/2 游离阿霉素 1.7ug/ml 0.3ug/ml 17.3h 阿霉素脂质体 20.9ug/ml 10ug/ml 69.3h DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)-胆固醇脂质体做成的药物,t1/2更长. 四、脂质体降低药物的毒性 一般的靶向制剂,主要被肝,脾,骨髓等网状内皮细胞丰富的 器官摄取绝大部份,而在心,肾中的积累量比游离药物低很多。 五、脂质体保护被包封药物 1)体外阻止药物的氧化或水解; 2)体内阻止酶的分解; 3)在靶区中,脂质体和细胞相互作用,或内吞进入细胞后,经溶 酶体的作用而其解体释放出药物。,脂质体制备技术课件,第三节 脂质体的组成,类型和理化性质 一、脂质体的组成和结构(见图) 脂质体=膜材料+附加剂 在磷脂的单分子结构中,具有两条疏水链和一条亲水链,在卵磷脂-胆固醇结构中,磷脂分子构成一种“手杖”状态,亲水基相互靠拢,具有两个亲油基。(如上图) 二、脂质体的类型 (一)按脂质体结构和粒径分类 SUV 粒径200nm 1、单室脂质体 LUV 粒径2001000nm note:SUV在循环系统停留较长,靶性强,包封容积小,包封率低 LUV膜不够稳定 2、多室脂质体MLV 3、多相脂质体 Note: 1)多室脂质体也称多层脂质体(MLV),粒径5um,药物溶 液被几层脂质双分子层所隔开形成不均匀的聚集体.,脂质体制备技术课件,2)MLV包封率高,稳定性好,容易制备 3)依制备方法, 1、 Bangham薄膜法制备的MLV MLV分类 2、Szoka逆相蒸发法制备的REV-MLV表示 3、Gruner改良逆相蒸发法制备的MLV为SMLV (稳定型多层脂质体) 4)多室脂质体,含有表面活性剂,是以单室或者多室脂质体为主及 少量的O/W或W/O/W型乳剂共混悬在水相的多相分散系。其主要优点可避免单室和多室脂质体,对脂溶性药物包封不全而呈较大油珠,符合静脉给药。 1、一般脂质体 热敏脂质体 (二)按功能分类 PH敏脂质体 2、特殊性能脂质体 多糖被复脂质体 免疫脂质体(IL) 超声,光敏,磁性脂质体 Note:1)多糖为糖脂类物质,2)IL中被抗体修饰,脂质体制备技术课件,(三)按脂质体电荷性分类 中性脂质体 脂质体 负电脂质体 正电脂质体 (四)按脂质体用途和给药途径分类 1、气雾化脂质体 6、外用,经皮给药脂质体 2、静脉注射脂质体 7、肌注、局部注射脂质体 3、口服给药脂质体 8、免疫诊断脂质体 4、眼部用药脂质体 9、基因工程,生物工程用脂质体 5、粘膜给药脂质体 10、其他用途,etc 三 脂质体的理化性质 (一)相变温度(Phase transition temperature) 脂质体脂的物理性质与介质的温度密切相关,当温度升高时,双分子层中酰基侧链从有序变为无序,引起脂膜的物理性质的一系列变化,可由“胶晶”态变为“液晶”态,双分子层厚度减小,膜流动性增加,这种转变时的温度称为相变温度。它取决于脂质,脂质体制备技术课件,体膜的磷脂的种类,与侧链R-C-基团的长短,酰基越长,则相变 O 温度越高,反之则越低。在相变温度时,脂质体内的药物具有最 大释放速率。 eg:二肉豆寇磷脂酰胆碱 24C 二棕榈酸磷脂酰胆碱 41C 二硬脂酰磷脂酰胆碱 58C 胆固醇具有调节膜流动性的作用,当在脂质体膜中加入50% (质量分数),可使膜相变消失。 Papahad joponlos称“胆固醇为流动性缓冲剂”(fluidity buffen) 研究发现低于相变温度时,磷脂中加胆固醇则可使膜减少有序排列 增加膜流动性,高于相变温度时加胆固醇则可增加膜的有序排列而 减少流动性。 脂质体的膜材常由两种以上磷脂组成,它们各有特定的相变温 度,在一定的环境下,它们可以同时存在不同的相,称之为相分离。 (phase separations) Sackmann曾用自旋共振光谱证明磷酯酰胆碱:磷脂酸(1:1)混合,脂质体制备技术课件,膜中,加多粘菌素其多粘菌素可与磷脂酸结合而诱发脂膜形成区 块结构(Clomain structure) (二)脂质体的荷电性 脂质体含酸性脂质组分多时,荷负电。Eg:PA PS含碱基 (胺) 荷正电 不含离子的脂质体,显电中性 其检测方法:荧光法 显微电泳法 荷电性直接与脂质体,包封率,稳定性,靶器分布,靶细胞作 用有关 (三)脂质体,粒径和粒度分布 采用显微镜,电镜,Coulter计数法,激光散射法,微孔滤 膜-吸光度法 对脂质体粒径和粒度分布的影响,主要受制备方法和类脂 用量的影响 超声法 制备 小单室脂质体SUV 乙醇注入法,脂质体制备技术课件,乙醚注入法 大单室脂质体LUV Ca2+融合法 LUV 超声 Ca2+ 融合 LUV MLV SUV MLV 加类脂用量 第四节: 脂质体的制备技术 近20年来,人们对脂质体的制备进行了大量研究,目前制备的方法颇多,这里只介绍常见的几种方法。 一,制备方法 (一)薄膜法:又称干膜分散法(TFV),最早由Bamgham报道 加适量CHCl3 薄膜干燥 方法:磷脂膜材 脂溶性药物可加溶剂中 薄膜 干膜超声法 缓冲液(含水溶 薄膜振荡分散法 性药物)振摇 薄膜匀化法 大多层脂质体 薄膜挤压法 For example:P116, VitB12脂质体,生育酚脂质体制备,脂质体制备技术课件,(二)逆相蒸发法 最初由Szoka提出此法 方法: CHCl3orEt2O 药物水溶液 短时超声 磷脂膜材 溶液 W/O乳剂 减压蒸发 凝胶色谱 减压蒸发 滴加缓冲液 CHCl3orEt2O 大多层脂质体 混悬液 胶态状物 (2001000 nm ) 离心 旋转蒸发器上旋转 包封率60% 本法的关键:在于磷脂:有机溶剂:含药缓冲液三者比例 一般有机相:水相(24:1)较适宜 适合包裹水溶性药物,生物大分子,抗生素etc for example:P117 1)伯氨喹脂质体制备 2)胰岛素脂质体制备 (三)复乳法 本法首先是由Matsumoto报道,脂质体制备技术课件,方法: 乳化 减压除部分溶剂 加大量水相 少量水相+多量磷脂油相 W/O反相胶团 也可不除溶剂 乳化 蒸发有机溶剂 W/O/W复乳 脂质体(包封率20%80%) For example: 甲氨喋呤脂质体的制备 P117 类似的方法有改良复乳法,Kin复乳法。 P117 其中Kin法制备的脂质体是一种优良的生物模型 (四)熔融法 此法首先由顾学裘等报道 方法: 少量水相溶解 65C水相 磷脂+表面活性剂 油相 脂质体 熔融 保温 胆固醇 该法不同有机溶剂,适合于工业生产 for example:1395(高三尖杉酯碱)脂质体制备P118,脂质体制备技术课件,(五)注入法 此法最早由Deamer发表 方法: Et2O或EtOH 类脂质+脂溶性药物 油相 乳匀或 搅拌 脂质体 混悬液 水相(或含水溶性药物) 超声 挥尽有机溶剂(有机
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