黄曲霉检测方法研究进展综述科技论文写作与实践课程论文黄曲霉毒素检测方法研究进展姓 名：谢桂焕专业年级：09生物信息学学 号：090567011总 成 绩：完成时间：2012-11-13黄曲霉毒素检测方法研究进展谢桂焕（福建农林大学生命科学学院09生物信息学 福州350002）摘要:黄曲霉毒素是剧毒性物质，多在食品中发现，对人类危害极 大。概述了黄曲霉毒素的理化性质及危害，讨论了黄曲霉毒素的各种检测 方法如薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等，并对未来黄曲 霉毒素的检测方法进行了展望。关键词：黄曲霉素；危害；检测方法引言：食品安全是人们都极其关注的，尤其是绿色食品和有机食品概 念的提出更加增加人们对食品安全的关注。食品安全的影响因素很多，其 中AF的危害是比较突出的一个问题。黄曲霉毒素（Aflatoxin,简称AF）是由真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的一 组强毒性的次生代谢产物，尤其AFB1是冃前发现的真菌类毒素中毒性最大、 污染范围最广的毒素之一2。对它的研究是目前国内外关注的热点。在世 界不同地区发现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中,AF污染已导 致严重的食品安全问题。自20世纪60年代以來，冇关AF的危害被大量 报道，以致AF己成为最受人们关注的一种真菌毒素。因此，寻求准确、快 速、简便的检测方法，对AF进行高效的定性定量的分析，是AF研究的 一个重要方面。正文1 AF的概况AFT在紫外线下发特定的荧光，根据荧光颜色不同，将其分为蓝紫色 荧光的B族和黄绿色荧光的G族两大类及其衍生物。最具有代表性为 AFB2、黄曲霉毒B2( AFB2)、黄曲霉毒素Gl( AFG1)、黄曲霉毒素G2 (AFG2) o AF难溶于水、己烷、石油醴，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、二甲 基甲酰胺等有机溶剂。在中性溶液中较稳定，在强酸性溶液中稍冇分解， 在pH9-10的强碱溶液中迅速分解成无毒的盐，易被碱或强氧化剂破坏。纯 品为无色结晶，耐高温，分解温度为268e,紫外线对低浓度AF有一定的破 坏性。在自然条件下，食品中AF稳定性很强。被AFB1污染的稻谷，室温 下自然存放可长达20多a。AF主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米等食物中，食用了被AF 污染的食物后，会对机体造成损害甚至危及生命。AF对人和动物危害与AF 抑制蛋白质的合成有关。研究表明6-7, AF的细胞毒作用是干扰RNA和 DNA的合成，进而干扰细胞蛋白质的合成，导致全身性伤害。AFB1具有 很强的致畸、致癌、致突变的作用，其毒性因动物的种类、年龄、性别、 体况以及营养状况的不同存在差异，年幼动物、雄性动物较敏感，主要损 害动物的肝脏。经常食用含有AF饲料的奶牛，其产奶量明显下降，同时奶中含有代谢物AFM1和AFM2等毒素。人 食用了被AF污染的食物，会通过消化系统进入肝脏、肾脏等内脏中，部分 会存在肌肉等组织中。试验证明，用含有AF的食物来喂食小鼠，其先后出 现肝癌、胃癌、肾小管腺癌等病变。AFB1与DNA的共价结合抑制DNA的 甲基化，从而改变基因表达和细胞分化，激活哺乳动物细胞内致癌基因的 转化形成。食用被AFT污染的食品，会出现急性中毒，临床表现以黄疸为 主，并有呕吐、厌食和发烧等症状，重症者甚至死亡。2、检测方法2.1薄层层析法(TLC)TLC是测定AF的主要方法，多数国家都把它做为国标中的主要测定方 法。其原理是样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层板展开分离后，在 365nm紫外灯下,AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别显示紫色、蓝紫色、绿 色和绿色荧光。并根据其在薄层上显示的最低检出量來确定其含量。所用 设备简单、费用低廉、容易掌握，适用大量样品的分离、筛选，一般的实验 室均可开展，属于定性和半定量检测。Stroka 8开发出的光度检测器在检测AF时最低限可以检测到lngo Otta等在TLC结合光度计，不仅能把样品提纯，而且也能同时1次对 多个样品进行检测。江湖等10利用TLC检测农产品中的AFT, AFBJAFB2、 AFGl、AFG2的检出限达018、014、017、014Lg/ kgo TLC有单向展开和双 向展开法，其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质，提高灵敏度，省 略了柱层析等净操作步骤。TLC法由于设备简单，一般实验室都能满足，利 于普及，仍是现在检测AFT的主要方法之一。2.2高效液相色谱法（HTLC）HPLC具有高分辨率，分析时间较短等优点llo用此方法检测黄曲霉 毒素一般要经过样品纯化、衍生，最后经HTLC荧光检测器检测。早期试 验研究中使用的正相色谱分离、紫外检测器测定HPLC的方法己被现代的 反相色谱分离和荧光检测器测定的方法所取代，并得到普遍应用和发展。 与紫外检测器相比较，荧光检测器具有灵敏度高、选择性好以及干扰峰少 的优点。由于AF的荧光强度较弱，直接测定会影响其灵敏度和准确度。 试验中可以对AF进行衍生以增强其荧光强度常用的衍生方法冇:柱前三氟 乙酸衔生方法、柱后碘衍生方法、柱后澳衍生方法和环状糊精衍生方法等。大多数研究中采用的色谱条件为：C18柱，流动相为甲醇、水，冇的 采用乙睛、异丙醇。宋欢12用高效液相色谱一荧光检测法检测饲料中的 黄曲毒素B1。采用C18色谱柱，甲醇：水（3:7）为流动相，荧光检测器 检测，激发波长365nm,发射波长455nm效果比较好。冯建蕃等13对发2酵玉米粉用甲醇一水（8:2, V/V）提取，经免疫亲柱（IAC）分离纯 化，在线光化学衍生器柱后衍生化后，反相HPLC荧光检测器测定黄曲霉 毒素Bl. B2、Gl G2的含量，得出该方法具有准确度高、重现性好、检 测限低、效率高等优点。2.3酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是抗原（或抗体）吸附剂和用酶标记的抗体（或抗原）与标木中的待测物（抗原和抗体）起特异的免疫学反应，用测定酶活力的方法 來增加测定的敏感度，是一种定性或半定量的方法。大致采用两种方法检 测AF: 种是用双抗体夹心法；另一种是用竞争法。免疫吸附法测定的试 剂盒及配套仪器、方法被列入国家标准(GB/T500922)1996第二法)。Holladay等14采取间接ELISA技术，检测了抗AFM1-牛血清白蛋白(AFTM1BSA)免疫原的特异性AFTM1抗体。为了使用方便，利用酶联免疫 原理研制出AF快速测试盒，能简便地定量测定AF含量。赵晓联等15应 用这种快速测试盒测定AF含量，先用三氯甲烷提取样品，过滤，收集并水 浴挥干提取液，再用甲醇溶解，最后用专用AF试剂盒测定。关于运用酶联 免疫法检测AFTB1的检测报道也较多，目前国外已冇较成熟的检测食品及 饲料中AFTB1等真菌毒素的ELISA试剂盒出售，我国自20世纪90年代以 來也冇一些以ELISA检测食品及饲料中AFTB1的研究报道。如陈福生16 报道了酱油中AFTB1的ELISA检测,方法简便、快速，回收率在82%以上与TLC法相比,ELISA法检出值更高。刘冬儿17报道了食品中AFTB1的ELISA 测定，线性范围0. 25 5. 00ng/mJ检测灵敏度达0. 015Lg/kg,比薄层色谱 提高了 300400倍，回收率大于89. 2%,精密度高测定时间短，只需4h。2.4其他方法2.4.1免疫亲和柱净化荧光光度法(SFB)SFB是新发展起来的一种检测AFT的方法，其设备轻便、自动化高、操作简单、检测灵敏、时间短，广泛应用于检测口常饲料中的AFT是否超 标。国外V-icam公司开发出的V2系列型荧光光度计，可以直接读取AFT的 总量。但用SFB法检测中药材中AFT的含量时；结果中出现很多假阳性，造 成结果不准确。王晶等18用SFB法快速检测口常食用酱油和醋样品中AFT 含量，其检出限分别是215Lg/ kg和ILg/ kg,添加回收率在85%以上。2.4.2金标免疫层析检测技术(GICA)金标免疫层析检测技术(GICA)是利用纳米金作为标记物的一种快速测 定方法，它能在很短的时间内测出AFB1的含量，并可以直接读取结果， 不需耍分离纯化样品，真正做到了一步检测，方便高效。邓省亮19等人 用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗AFB1单克隆抗体并喷于玻 璃纤维上,AFB1偶联抗原和二抗分别结合于硝酸纤维膜上，依次将样本垫、 胶金垫、硝酸纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。 结果表明：其灵敏度为5ng/mL,检测吋3间为lOmin,批内和批间重复性100%o假阳性率和假阴性率均为0。3、展望对于AFT的毒性及在食品中的污染情况，世界各国相继建立或正在建 立新的检测该毒素的方法，理想的分析方法应该是简单、快速、准确、冇 效、灵敏、特异、经济等。TLC对样品处理繁琐，试验过程复杂、耗时、易 受杂质干扰、准确性差，必须使用标准品，对试验人员危害大，且灵敏度差。 HPLC是近几年发展起来的检测方法，此法快速而准确，但所需仪器设备投 资大、对操作技术要求高，未能广泛使用。基于抗原抗体特异性反应建立 起来的ELISA分析法，具有特异性强、分析时间短的特点，而其灵敏度与 TLC或HPLC法相当或更高，样品前处理简单，提取后就可直接测定，不需 要净化过程，特异性强、灵敏度高、成本低，适于批量检测。由于酶本身 的不稳定性，用此方法检验AFT有可能带来假阳、阴性结果。GICA法具有 快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便、无需贵重仪器设备的 特点，所以开发快速检测试剂是将来一种新的发展方向。随着待测食品种类的扩大和食品基质成分的复杂化，来自食品中非测 定成分的干扰越来越多，因此，对检测样品纯化、检测手段的要求越来越 高。发展廉价、灵敏、特异、快速的净化手段和检测方法是今后的研究方 向。参考文献1 史贤明.食品安全与卫生M.北京：中国农业出版社,2003.2 杨小兵.食品污染与食品安全控制J.湖北预防医学z 2003, 16(1):15016 潘裁 庞广昌黄曲霉毒素与食品安全J江西食品工业,2004(3): 30031.4 王晶,王林，黄晓蓉.食品安全快速检测技术M.北京:化学工业出 版社，2002: 920102.5 林怡,黎乐群，彭涛，等.AFTB1代谢及致肝癌机制的研究进展J. 现代医药杂志,2007, 9 (12):131-133.6 马占锋哪种黄曲霉毒素检测方法最好J监督与选择,2005(4) :68-68.7 吴丹.黄曲霉毒素在粮食和食品中的危害及防治J.粮食加工，2007,32(3) :91-94.8 Str oka J.Development of a simpl 讦 iedde nsitometer for thedetermination ofaflatoxins by thin-layer chromatographyJ. Journal of Chromatography A, 2000,904:263-268.9 Otta K H, Papp E, Bagocsi B. Determinationof afla-toxins in food by overpressured-layer chromatogra-phicJ .Journal of Chromatography A, 2000, 882:11-16.10 江湖,熊勇华，许杨.黄曲霉毒素分析方法进展卩卫生研究,2005,34(3) :252-255.11 涂文升.高效液相色谱法同时检测食品中四种黄曲霉毒素卩中 华预防医学，2002, 36(5): 343-345.12 宋欢