实验性肝硬化大鼠细胞因子IL18、TNFa、IFN Y的变化及意义作者：党双锁，高宁，程延安，边静，王顺达，孙明珠【摘要】 目的探讨在四氯化碳(CC14)复合因素诱导实验性 肝硬化大鼠的形成过程中，白介素18(IL18)、肿瘤坏死因子a (TNFa)、Y干扰素(TFN Y)的变化及意义。方法 将80只清洁级雄性 SD大鼠随机分为正常对照组和造模2周组、4周组、6周组，每组20 只。予以CC14复合因素诱导大鼠肝硬化，并在2、4、6周3个时间点 分别处死6只大鼠。采用ELISA法检测大鼠血清IL18、TNF a、IFN Y和肝脏组织匀浆上清液中的IL 18含量；HE染色观察肝脏 的组织病理学变化。结果 CC14复合因素诱导的实验性大鼠，组织 病理学观察发现，2周时大鼠肝脏组织细胞肿胀变性，6周时有大量纤 维增生，部分肝组织有假小叶的形成；随着造模时间的延长，实验 大鼠血清IL 18、TNF a、IFN Y水平逐渐升高，造模6周组与 正常对照组比较差异有统计学意义(P< 0.01)；造模组肝脏组织匀 浆中TL 18随肝损害程度的加重而升高，造模6周组与正常对照组 比较差异有统计学意义(P<0. 01)。结论 在CC14复合因素诱导大鼠 肝硬化的形成过程中，TL 18、TNF a、TFN Y水平逐渐升高， 提示该3种细胞因子与肝硬化的形成及发展有关。【关键词】大鼠；肝硬化；白介素18；肿瘤坏死因子a； 丫干ABSTRACT- objective To investigar+er+he changes of iMerleukin 18 (IL 一 8)Umor necrosis facr+or a (TNF a) and iMerferon y (IFN y) levels of 二ver cirrhosis induced by Lhe composite factors of carbon ter+rachoride (CC14) in SD rats andc+h2.r significance, Mer+hods Totally 80 male SD 招-ts of coan class were randomly divided inr+o norma 一 control group (2。rar-t-s) and model groups)r+he laRer of which were furr+her divided inr+o three groups accordingr+0 theongr+h of administration 艺1119 namely2 week group (2 wk group)4week group (4 wk group) and 6 week group (6 wk group) - wir+h 20 raL s in each Six r氏 s were killed afr+er 2 wk- 4 wk and 6 wk adminisCraCionr+inlerespectively，The raC serum levels of IL 18) TNF Q and TFN Y andr+he hepar+ic homogenafe supernatant of IL 18 were defected by ELISA pathological changes of 二 verc+issues were observed by HE sr+ai fling- Resulr+s par+hoogic 巴 observation revealedr+ha-t inr+he mode 一 groups hepatic cells degenerated and swelled ar+week 2 while large amounc+s of fibrosis and pseudoobul es of some 二 verc+issues occurred at; week 6The serum levels of IL 18TNF Q and IFN y were gradually increased with the modeling cme) andthey were significantly higher in 6 week group than in normal control group (P&l t ;0. 01). (3)The 1 evel s of hepati c homogenate supernatant of IL 18 in the model groups were elevated with liver damage, and they were significantly higher in 6 week group than in normal control group (P<0.01). Conclusion During the formation of liver cirrhosis induced by composite factors of CCI4 in rats, TL 18, TNF ci and TFN Y level s gradually increase, suggesting that the three cytokines play a certain role during the occurrence of liver cirrhosis in rats.KEY WORDS: rat; liver cirrhosis; interleukin 18; tumor necrosi s factor (TNF a)； interferon Y (TFN Y)肝硬化是慢性肝损伤所共有的终末病理改变。在肝硬化的形 成中，有大量细胞因子通过参与调节组织细胞的损伤修复过程而发挥 作用1。新近发现，白介素18(interleukin 18, IL 18)是新的 致炎因子。研究发现，TL 18参与了佐疫调控，其过度表达可能引 起免疫系统紊乱和组织器官的免疫炎性损害。本研究通过建立四氯化 碳(CC14)复合因素诱导的大鼠肝硬化模型，动态检测造模组大鼠IL 18及相关细胞因子肿瘤坏死因子a (TNF cl)、y干扰素(TFN Y)水平的变化，初步探讨细胞因子在肝硬化形成中的作用及意义。1材料与方法1.1主要试剂及仪器CC14（分析纯）购自西安化学试剂厂；橄榄油（化学纯）、胆固 醇（分析纯）购自上海化学试剂公司；大鼠IL 18定量ELISA试剂盒 为美国Biosource公司生产，上海森雄科技有限公司进口分装；大鼠 TNF a、IFN Y定量ELISA试剂盒购自上海西唐生物有限公司；RIPA 裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；DG3021型酶联免疫检测仪为华 东电子管厂产品。1.2实验动物与分组清洁级雄性SD大鼠80只，34个月龄，体重360380g, 平均（36714. 12）g,购于西安交通大学医学院实验动物中心。据肝硬 化造模时间长短将SD大鼠随机分成4组：正常对照组、造模2周组、 造模4周组、造模6周组，每组20只。所有大鼠分笼饲养于西安交通 大学医学院实验动物房。正常对照组，自由取食且不做任何处理；造 模2、4、6周组，每周2次皮下注射400mL/L CC14橄榄油溶液3mL/kg, 首次剂量为5mL/kg；同时给予高脂饲料（80%单纯玉米粉+20%猪油 +0. 5%胆固醇）作为唯一饮食，并以300mL/L乙醇作为饮水饲养动物。 每周一、四注射，旦注射前称体重。于造换2、4、6周时各组分别随 机选取动物6只，水合氯醛腹腔内麻醉，腹主动脉插管取血，并留取 肝脏做组织匀浆及40g/L甲醛溶液固定，常规石蜡切片，HE染色。1. 3方法1.3. 1 ELISA 法测定血清 IL18、TNF a、IFN Y 水平血液3000r/min离心20min,吸取血清，采用双抗体夹心ELISA 法测定，严格按照说明书操作。1. 3. 2 ELISA法测定肝组织匀浆中IL 18水平取大鼠部分肝脏组织，冰冷等渗盐水漂洗数次后，除去血液, 滤纸吸干，称取lg肝组织，用手动匀浆器将肝组织在磷酸盐缓冲溶液 (PBS)和0. Immol/L苯甲基磺酰氟化物(PMSF)中充分研磨匀浆， 100000r/min4C离心15min,取上清液，采用双抗体夹心ELISA法测 定，严格按照说明书操作。1.4统计学方法采用SPSS 13.0统计软件处理。计量资料数据以土s表示，进行单因素方差分析，各组间比较采用LSD t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1大鼠肝脏的组织病理学改变正常大鼠肝组织细胞大小一致，细胞排列呈条索状，以中央静 脉为中心呈放射状，肝窦无狭窄，小叶及汇管区无炎细胞浸润（图1A）。 CC14复合因素诱导2周后，大鼠肝脏充血、肿胀，包膜紧张,镜下肝 细胞肿胀，呈气球样变，以汇管区周围较明显（图1B）； 4周后大鼠肝 脏充血、肿胀进一步加重，镜下见大面积肝细胞变性和坏死，坏死以 小叶周围显著，汇管区少量炎症细胞浸润及纤维组织增生（图10； 6 周后大鼠肝脏充血、肿胀消退，肝脏轻度萎缩，镜下汇管区纤维增生, 并向小叶内伸展，见不完整假小叶形成（图1D）。2.2大鼠血清IL 18、TNF a、IFN V水平的动态变化与正常对照组相比，造模2周组大鼠血清IL 18、TNF a 的差异有统计学意义（P&l t;0.01）,而TFN Y差异无统计学意义 （P>；0. 05）； 4 周、6 周造模组大鼠血清 IL 18、TNF Q、IFN V明显增高，与正常对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）o各 造模组间比较，6周组TL 18、TNF a、TFN Y水平较2、4周组 明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01,表1）。表1各组大鼠血 清TL 18、TNF a、TFNY水平的比较（略）2. 3大鼠肝组织匀浆中TL 18水平的变化与正常对照组相比，4、6周造模组大鼠肝组织匀浆中IL 18增高,差异有统计学意义(P<0.01),旦6周组肝组织匀浆中TL 18较2、4周组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01,表2)。 表2各组大鼠肝组织匀浆中TL 18水平的比较(略)3讨论1995年0KAMURA等2对感染疮疱棒状杆菌(P.acnes)的小鼠肝脏 提取物用脂多糖(LPS)加强刺激，可诱导出使TFN Y高水平表达的因 子，最初把该因子称作IFN 丫诱导因子(IGIF)o进一步研究发现， 这是一种新的炎性细胞因子，有亲多种组织的免疫活性，命名为白介 素183。目前研究发现，TL 18是由活化的巨噬细胞产生的一种强 有力的免疫调节细胞因子，具有多种生物学活性：诱导Thl细胞、NK 细胞等多种免疫细胞产生TFNY、TNF ci、Fas配体及穿孔素；促进T细胞增殖4；增强FasL介导的Thl细胞、自然杀伤细胞(NK)的 细胞毒活性作用，导致肝实质细胞的免疫性损伤5 o本研究结果表明，在CC14复合因素诱导大鼠肝硬化形成的6 周中，血清细胞因子TL 18、TNF a、TFN Y水平均高于正常对