乳酸菌在青贮中的应用及研究进展青贮饲料在世界各地有着悠久的发展历史。据考证，青贮饲料起源于古埃及 文化鼎盛时期在我国，在600多年前的元代(王祯农书)和清代(风广义) U记载着 有苜蓿、马齿苑等青饲料的发酵方法。但实际应用于生产是在18世纪初期，1885 年德国人库英(G. Kuin)及G.Frg报道了青贮饲料技术方面的文章；我国最早关 于青贮饲料的试验研究报道是1944年发表于西北农林的“玉米窖贮藏青贮 料调制试验 1943年西北农学院教授王栋、助教卢得仁首次进行带棒玉米窖贮 藏青饲料，并向陕西及全国推广。青贮饲料是一个复杂的微生物共生体系，主要包括乳酸菌、酵母菌、芽泡杆 菌、乙酸菌、梭状芽饱杆菌等，其中以乳酸菌的数量和利喽最多，也是在青贮饲 料发酵中起主要作用的微生物。微生物青贮剂，亦称青贮接种菌、生物青贮剂、 青贮饲料发酵剂，是专门用于饲料青贮的一类微生物添加剂，由一种或一种以上 乳酸菌、酶和一些营养物组成，采用人工加入菌种的方法，有利于这类乳酸菌尽 快达到足够的数量，加快乳酸菌发酵产酸，决定着青贮质量的好坏。乳酸菌是促使青贮饲料发酵的主要微生物，是指-类以糖为原料的消耗葡 萄糖50%以上、厌氧型、产生乳酸、革蓝氏阳性，不形成芽泡的细菌。乳峻菌依 其发酵糖生产乳酸的能力分为两类，一种是同型发酵乳酸萌;另-类是异型发酵 乳酸菌。同型发酵乳酸菌在生产乳酸和青贮饲料方面更有效，耗能更少，而且容 易保存营养物质，属于比较经济的发酵类型。青贮能否成功在很大程度上取决 于同型乳酸菌能否迅速大量繁殖，筛选并培养最适合的乳酸菌是关键，调节青 贮料内微生物区系，调控青贮发酵过程，促进多糖与粗纤维的转化，从而有效 地提高青贮饲料的质量。这是近三十年来青贮研究的热点，目前国内应用存在着 一些不足，如产品菌种单一，联合应用的少、贮存期短，活菌数低等等。因此 从多角度研究乳酸菌的性质和应用仍具有很大的空间。乳酸菌制剂：理想的青贮应是乳酸菌控制整个发酵过程，乳酸生成占绝对 优势。乳峻菌制剂的添加或直接接种乳酸菌可以加快乳酸菌发酵进程，改善青 贮发酵品质,如Seale等(1986 )研究报道其添加效果明显。Muck (1996)的 研究指出，采食添加乳酸菌制剂的青贮料的家畜，产奶量和曰增重显著提高。 Filya等(2007)研究表明，乳酸菌接种剂对于苜蓿青贮有积极的效果，可以 降低pH值，改善发酵品质。以上结果表明接种乳酸菌或添加乳酸菌制剂会直接 或间接地影响动物生产性能。目前主要使用的菌种有Lac tobacillus plantarum , EnterococcusfaeciumW Pediococcus pentosaceus 等。近年来，Ohshima等人进行的大量的绿色发酵汁(PFJ)调制青贮的研究。PFJ 类似于乳酸菌制剂，它通过发酵培养植株的固有乳酸菌以达到乳酸菌迅速增殖 的目的而制得。添加PFJ降低生产成本，工艺流程简单，而旦添加入贮料可迅速 提高贮料中的乳酸含量，降低pH值，抑制梭菌活动，保护蛋白质的分解损失，且 其添加效果不受青贮原料生育期、DM含量及青贮条件的影响，在改善青贮发酵 品质方面较乳酸菌更稳定。PFJ可以使附着在牧草表面的乳酸菌群增值，作为乳 酸发酵的启动因子，显示它的有效性。它称之为乳酸菌制剂的一种良好替代品。 Li-MaoCao, Mitsuaki Ohshima等(1999)添加入PFJ对第一茬首蓿青贮品质进行 研究，得出2.5 mg/kg PFJ对于促进乳峻发酵，抑制醋峻和氨的形成有效。碳水化合物类：碳水化合物类添加剂能够直接弥补乳酸菌发酵底物少的缺 陷，对于克服豆科牧草的高缓冲能特性是必需的，如糖蜜，糖蜜是制糖工业 的副产物，添加入糖蜜的青贮料pH及NH3-N含量降低，乳酸、可溶性糖含量增 加，同样对于葡萄糖的添加，研究添加葡萄糖，苜稽青贮被很好地制备。另- ,类 是细胞壁降解酶，主要作用于两个方面：首先是降解细胞壁成分，增加青贮发 酵底物，促进乳酸发酵优势的形成；其次是酶降解作用后易被瘤胃微生物作用， 有机物消化率提高。YuZhu, NaokiNishino等报道添加了细胞壁降解酶的苜蓿青 贮同对照相比，乳酸含量提高(P0.01), pH值下降(P 0.01),而且对处理过 的青贮料进行瘤胃降解发现其中快速可降解的DM不受影响。可见酶制剂用作青 贮添加剂不只是保存剂，更重要的是作为品质改良剂。在青贮中添加纤维素酶 有助于植物细胞壁的分解，提供更多的碳水化合物以促进青贮发酵，使植物纤 维成分含量下降，改善牧草的营养价值，从而引起家畜生产性能的提高。乳酸菌是微生物青贮剂中最早应用的菌种，研究最多、最透彻。近年来，许 多学者对乳酸菌性质，特别是分子生物学方面进行了研究，取得了新的进展。 应用于细菌分类学的一系列基于DXA的鉴定方法发展十分迅速。基因型乳酸菌鉴 定方法大多依赖于PCR来选择性的扩增特殊目的DXA片段，从而得到所需要的信 息，不同的基因型方法展示不同的分类水平。而且这类方法最大的优点是不依 赖培养条件，不会因为培养条件的变化而产生不同的结果。Kaufmann等设计了 扩增双歧杆bifidobacteria) 16SrDNA片段的特殊引物，能检测分离到的双歧 杆菌属-种的水平。在属的水平上，利用扩增16SrRNA的方法将分离自乳酪的543 株乳酸菌鉴别到种的水平。黄良昌等对培养保加利亚乳杆菌的基础培养基进行筛 选，确定为MRS培养基。然后优化培养条件:发酵时问为12 h,起始pH值为5. 80, 发酵温度为40 C o最佳培养基：MRS培养基+7.5%番茄汁+12%麦芽汁 +0. 009mol/LCaC12+2%乳清。通过中和试验，保加利亚乳杆菌菌体浓度可达到 9. 55X 109个/niL。李霞等应用改良MRS培养基对保加利亚乳杆菌进行了超浓缩 培养，在培养过程中，采用了离心式半连续培养技术，并对2次培养后的培养基 进行了改良，最终使菌体浓度达到1.045X1010个/mL。测定了保加利亚乳杆菌 超浓缩培养过程中各种生化代谢规律的变化，结果表明：在超浓缩培养过程中， 祛除代谢产物和添加底物可以明显地提高菌体的数量。近年来，对表多糖的研究 被人们关注。2006年Schiraldi C等关于提高表多糖的研究，他们选用的菌株 先用摇瓶培养，然后在发酵罐中用葡萄糖和乳糖作为主要碳源，酪豚作为辅助组 分，在3542C进行发酵试验，通过比色法和色谱仪进行探测表多糖产量，发 现用微量过滤法可使表多糖的产量提高3倍，使用微量过滤法发酵对表多糖的最 优化生产策略允许批量地生产。2006年We Iman AD等关于提高保加利亚乳杆菌 表多糖的糖甘前体分泌量的新陈代谢的研究，通过2种不同的方法来提高表多糖 的产出率。一种方法是通过对比2种不同的菌株(-株是原始的亲本，另-株是 经化学法诱变的高产菌株)的表多糖的产量，发现与一种酶的活性有关，这种叫 尿核昔二磷酸果糖差向异构酶的物质在表多糖的产量上起着非常重要的作用。另 一种方法是调查亲本糖首代谢的增长率的影响，实验表明，表多糖的产率也随糖 甘代谢增长而升高。因此只要提高糖昔的代谢，表多糖的产量自然也会提高。黄 红等近几年来，人们加强了乳酸菌素的研究，日前国内外报道的乳酸菌素40多 种，乳酸菌素是在乳酸菌代谢过程中，合成并分泌到环境中的一类对革兰氏阳性 菌(尤其是亲缘性较近的细菌)具有抑制作用的杀菌蛋白或多肽。它们分别由乳 球菌、片球菌、明吊球菌、乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、链球菌、肉食杆菌等属 的菌株产生。乳酸菌可以通过其代谢产物，主要是酸性物质和乳酸菌素等，起到 有效的抑菌作用。乳酸菌素的功能类似抗菌素，但作用机制不同，具专一性，完 全不产生抗药性及毒性，可有效抑制病原菌的生长。乳酸菌素的代谢产物（Nisin 乳链菌肽），能有效地抑制多种导致腐败的革兰氏阳性菌尤其对多产芽泡的细菌 特别有效，是一种高效、无毒的天然抑菌剂。抑菌实验表明，它们不仅对革兰氏 阳性细菌有抑制作用，而且对革兰氏阴性细菌特别是致病的一些革兰氏阳性细菌 及阴性细菌，如大肠杆菌、单胞增生利斯特菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、福 氏志贺氏菌均有不同程度的抑制作用，故可治疗胃、肠炎。乳酸菌素能促进胃液 分泌，增强胃肠蠕动，促进食物消化。乳峻菌素是多肽物质，食用后，在消化道 很快被蛋白水解酶吸收，因而不会影响肠道内的正常菌体存活，可以改善肠道微 环境。乳酸菌素能选择性杀死肠道治病菌，保护和促进有益菌的生长，调节肠粘 膜电解质、水分平衡，调节胃肠道菌群平衡，改善肠道微环境。微生态制剂乳酸 菌素具有免疫调节作用，增强机体的特异性与非特异性免疫物质，激活吞噬细胞 酶的活性，选择性地杀死肠道致病菌，促进有益菌的生长。刺激肠道产生IgA, 增强机体的细胞免疫和体液免疫，提高肠道免疫力。鉴于乳酸菌素的高效性和安 全性，有关含乳酸菌素的应用将会有越来越广阔的前景。自2001年完成第一株乳酸菌即乳酸乳球菌TL 1403的全基因组测序以来， 日前已经公布的测序完成的乳酸菌包括：乳峻乳球菌IU403、长双歧杆菌 NCC2705、植物乳杆菌WCSF1、约氏乳杆菌NCC533以及嗜酸乳杆菌 NCFM/ATCC700396等。乳酸菌基因组的大小在一个特定的范围内，从1.82. 6 Mb 不等，只有植物乳杆菌相对较大，为3.3 Mbo乳酸杆菌和双歧杆菌这2种革兰 阳性菌分别具有较低和较高的GC含量，乳酸杆菌的GC含量从30. 9%-50%不等, 而长双歧杆菌则高至60. l%o此外，还有一些乳酸菌具有非常复杂的插入重复序 列（IS）,说明这些菌有较高的遗传可塑性。植物乳杆菌具有大量可以编码磷酸烯 醇内酮酸依赖的磷酸转移酶（PTS）以及其它的糖转运系统相关酶类的基因。由于 乳酸菌在青贮饲料中有很重要的作用，从而激发了人们对染色体外遗传物质即 质粒的研究。质粒是一段存在于染色体外或整合在染色体上的共价闭合环状双链 DNA分子，含50100基因。质粒可独立存在于细菌染色体外，能够进行自我复 制、稳定遗传和表达;也可整合和消失，并可在一定范围内进行细胞间传递。许 多次生代谢产物（如抗生素、色素）的合成一般受质粒控制。质粒并非细萌生命活 动必需，但可携带决定细菌某些遗传特性的基因，是遗传上程的重要载体。日前, 已有多种方法可从细菌中提取质粒DNA,如碱裂解法、煮沸法、微波炉法，此外 还有有机溶剂法等。乳酸菌质粒的研究对于筛选新的优良菌种，改良现有的生 产菌种具有良好的作用。如果把异型发酵菌种中可以调高有氧稳定性的基因，通 过基因重组，建立良好的基因上具，再加入同型发酵菌中进行改良，则可为饲料 工业带来巨大的经济效益、社会效益和生态效益。随着人们对乳酸菌功能了解的深入，乳酸菌的生物青贮剂的需求量也将进 一步增大，因此对应用于青贮的乳酸菌种进一步研究和开发有着重要的意义， 更高的活性，不同类型乳峻菌株的相互作用机理对青贮的影响等，都将会对青贮 品质的提高有着深远的影响。总之，未来乳酸菌的应用范围将更广，功能将更加 完备，乳酸菌的研发和应用将有更广阔的前景。