基因重组技术工具酶Cohen and his colleagues completed the first gene recombinant experiment in 1973. Hybrid DNA obtained by gene recombination and transformation in vitro was transformed into E.coli in vitro. Necessary material： endonuclease Ligase Vector host cellsGene cloning (molecular cloning)通过体外重组技术，将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体 细胞，扩增形成大量子代分子的过程。基因克隆的核心体外重组(Recombination):人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。PlasmidHybridization + DNA lie。零。Foreign DNA reg*on of interestRecomb DNADNA insetionBactenaBactenal chromosomeBactena plotted on medium anhbtoticOnly bactcna containing recombsnMt DNA growI O c cCulture |O DNApurification Cloning into a plasmid基因工程常用的工具酶限制性核酸内切酶 切割DNADNA连接酶生成3 - 5磷DNA聚合酶I反转录酶探针标记、补平3，末瑞cDNA合成多聚被甘酸激酶5 磷酸化、探针标记末磷转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末瑞磷酸基限制酶的特点(a) 识别顺序和酶切位点识别4.8个相连的核甘酸；呈回文结构；对称性；切点大多数在识别顺序之内，也有例外。限制酶切后产生两个末端，5，.P和3，.0H相容性末端：可连接在一 起。如：BamHI (GGATCC)与Mbol (NG A T CN)酶切产生的末端，相连后Mbol仍可识别，但BamHI的识别只有十六分之 一的可能性。又如：BamHI和Bglll(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所 识别和酶切。(b) 末端种类Three kind terminals after digested by endonucleasesa) 5projected stick terminal (突出的粘性末端)For example, EcoR I 5GAATTC33-CTTAAG-5b) 3 projected stick terminal (突出的粘性末端)For example, Pst I 5CTGCAG33-GACGTC5c) Blunted terminal (平末端)For example, Sma I 5-CCCGGG33GGGCCC5异源同序酶(isoschizomer,同裂酶)定义：能识别相同顺序但来源不同的两种限制性内切酶。特点：1)识别相同顺序2)切割位点的异同，如Asp718-Kpnl；SaclSstl(6)限制酶的星号反应活性(staractivity)(a) 特点：限制酶识别序列特异性降低(b) 发生星反应的限制酶和条件(c) 星反应的利用和避免同裂酶(Isoschizomers ):是指来源不同的核酸内切酶，识别序列相同，切割位点 可以相同也可以不同，这类酶称。同尾酶(Isocaudamers ):是指识别核酸序列不同，但有相关序列，切割的粘端序 列相同远距离裂解酶(Distant cleavage):识别位点与切割位点不一致，但其切割位点与 识别位点的距离是一定的，一般为10个碱基左右。如：Mbo II的识别序列为5七GAAGA.3切割位点在识别位点下游第8个核昔酸。可变酶：识别序列中有几个核昔酸是可变的，识别序列通常大于6个碱基对。X -Terminase是识别入噬菌体DNA的cos序列(100 bp),并形成附带12 base的5七末端的用以切断双链DNA的酶,出现的频率约412 o本酶能够有效地切断cos序列。因此，不仅能够用于Cosmid mapping,还能作为 cos序列特异性的限制酶使用。Omega核酸酶(l.Scel)：由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418 =6.9 X 1010 bp限制性内切酶的用途a. DNA重组b. 限制酶(物理)图谱绘制c. 突变分析(RFLP分析)d. 限制酶的部分酶切与完全酶切2. DNA 甲基化酶 Methylase 甲基化酶的利啖与识别顺序a. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嚅喘和腺喋吟发生甲基化，形成5甲基胞嚅嚏和6 甲基腺喋吟：在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的 识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。b. E. coli的dam、dem甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。dam G mATC, dem C mCA/TGGc. 哺乳动物的甲基化酶该酶可使CG中的胞n密咬甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过 程有关。d. E. coliP依赖于甲基化的限制修饰系统mrr (mA/A)、mcrAm5CG merB (Pum5C)(2) 甲基化酶活性对限制酶活性的影响a. dem和dam甲基化酶对限制酶的影响抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠如：完全重叠Bell-dam； ScrFI-dcm边界重叠 Clal-dam； Sau96l-dcm不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠。如:dam-BamHI, Sau3AI, Bglll, Pvul； dcm-BstNI米下横线字母表示限制酶识别序列,蓝色字母表示dam甲基化酶识IIIb.ll型甲基化酶对限制酶活性的影响 抑制同种限制酶的活性表2对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶识别序列*甲基化酶AvailGG (A/T) CC (A/T) GGdemBclTGATCAdamClalGATCGATdamEc* IICC(A/T)GGdemHphGGTGATCdamMbo IGATCdamNruGATCGCGAdamSaiQ6 IGGNCC(A/T)GGdemSadF ICC(A/T)GGdemStu IAGGCCTGGdemTagGATCGAdamXba ITCTAGATCdam别序列，红色字母表示dem甲基化酶识别序列(a) RNase A分离日牛月臾脏，对热稳定，抗去污剂(100 C加热15min仍具活性), 用于除去DNA样品中的RNA分子。(b) 核酸酶S7,亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNAo(10 ) RNase H作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便 第二条链cDNA链的合成。(11) DNase I(a)特点：具内切酶活性，作用于ds-DNA,但无核昔酸序列特异型，产生5,P低聚核甘酸;Ca2+, Mg 2+或Ca2+, Mn2+可使酶活达最大值当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链 上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存 在时，两条链上的切口几乎在同一位置4 DNA 聚合酶 DNA Polymerase(1) E.coli DNA 聚合酶 I (polymerase I)(a) E.coli的DNA聚合酶系统Pol I参与DNA修复 具3 5和5，一3，外切酶活性polll同上具3 5外切酶活性pol III参与DNA复制 具3 5和5 -3外切酶活性(b) E.coli poll 的特点具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大 小不同的片段，其中小片段具5 3外切酶活性，大片段具3 5外切酶 活性(大片段亦称为Klenow片段,pollK)(b)用途：(1) 将双链DNA的末端转化成平端；(2) 标记用作探针的DNA片断；(3) 对带有3凸出端或平端DNA分子进行末端标记，分两步进行；(4) 补平或标记限制性内切酶消化DNA所产生的3凹末端；必须在高浓度的4dNTP存在下，抑制3 5外切酶活性；RNA聚合酶(1) SP6RNA聚合酶 和T7RNA聚合酶(a) 特点：依赖于DNA的RNA聚合酶，具SP6启动子特异型(b) 用途：主要用于RNA分子的体外合成，合成的RNA分子可用于：分子的拼接研究标记的RNA常用于杂交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标 记，产生的RNA具高放射比活性基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置还可以用于蛋白质的合成研究(3) T3RNA聚合酶(4) E.coli RNA 聚合酶连接酶Ligase(1) T4DNA连接酶(a) 特点：只连接ds-DNA分子，要求3-羟基和5-磷酸基团。(b) 用途：用于不同DNA分子的连接，形成重组DNA分子相同或相容粘性末端的连接平整末端的相连淤DNA平端来源：限制酶作用结果；限制酶与其它酶共同作用结果平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多抑制剂 PO43-5mM, NaCI25mM, Ca+0.1mM(2) E.coli DNA 连接酶只能连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子(3) T4RNA连接酶参与单链RNA分子的连接主要用于提高T4 DNA连接酶在连接反应中的连接效率(20倍)