第三章 基因工程常用的载体 1载体的定义nVectornAn agent such as a plasmid used to transfer DNA into a host cell载体的功能n承载的外源DNA片段(基因) 进入宿主细胞进行扩增和表达的工具nDNA分子载体的一般要求在合适的位置有1至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子能携带外源DNA片段进入受体细胞，或停留在细胞质中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制必须具有用于选择克隆子的标记基因必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。 载体的分类（举例）n构建载体的DNA来源n质粒载体n病毒或噬菌体载体n质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体n质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体n应用范围n克隆载体n表达载体n启动子探针型载体n穿梭载体n应用对象n原核生物克隆载体n植物克隆载体n动物克隆载体是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1 3个抗药性基因，以利于筛选。第一节：质粒（plasmid）载体大肠杆菌的3种质粒（研究较多）nF质粒：F因子，能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去n R质粒：抗药性因子，编码有一种或数种抗菌素抗性基因nCol质粒：大肠杆菌素因子，编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。一、 质粒的一般生物学特性质粒 n存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份，绝大多数的质粒都是环形双链DNA分子n结构比病毒还简单的亚细胞有机体n没有蛋白质外壳n没有细胞外的生命周期n随寄主细胞的分裂而遗传n广泛存在于多种细菌中，少数真核生物 n也有RNA质粒（酵母的杀伤质粒(killer plasmid) ） 1 质粒DNAn绝大多数是环形双链DNA分子n染色体外的游离状态n可逆整合到寄主染色体上 质粒DNA分子三种构型n共价闭合环形DNA (cccDNA)：其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA (cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型n开环DNA(ocDNA)：两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)，此即OC构型n线性分子(lDNA)：质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子(lDNA)，通称L构型 共价闭合环形DNASC构型开环DNAOC构型线性分子L构型 2质粒DNA编码的表型n质粒编码一些重要的非染色体控制的遗传性状n赋予寄主细菌一些额外的特性， 3 质粒DNA的转移 质粒的类型质粒的类型n接合型的质粒(conjugative plasmid)，又叫自我转移的质粒。它们除了具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因n非接合型的质粒(nonconjugative plasmid)，亦叫不能自我转移的质粒。它们虽然具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此是不能够从一个细胞自我转移到另一个细胞。 nF因子：致育因子(fertility factor) n能够通过接合作用实现自我转移n带动寄主染色体一道转移nF质粒有三种不同的存在方式： n以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA区段。这样的细胞叫做F+细胞。 n以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上还携带着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F 细胞。n以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样的细胞叫做Hfr细胞(高频重组细胞)。n最有代表性的单拷贝的接合型质粒，总共编码着19个转移基因(tra)n从基因工程的安全角度考虑，我们感兴趣的是非接合型的质粒。4质粒DNA的迁移作用 n非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的n由接合型质粒引发共存的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用 5质粒DNA的复制类型 n低拷贝数的质粒，每个寄主细胞中仅含有13份的拷贝，我们称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid)n高拷贝数的质粒，每个寄主细胞中可高达1060份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)。 n一般规律：n 接合型高分子量拷贝数少严紧型n 非接合型低分子量拷贝数多松弛型n质粒的复制不仅受自身的制约，而且还受到寄主的控制 若干通用的质粒复制基因的的特性6质粒的不亲和性n所谓质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥(稀释)掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒 n不亲和群(incompatibility group) 一种质粒产生的阻遏蛋白质会影响不亲和质粒的复制 第二节 质粒载体的构建及其类型 一、天然质粒作为克隆载体的局限性 n天然质粒：未经过人为体外修饰的质粒n常见的有：ColE1, RSF2124, pSC101 n分子量较大，拷贝数较低，不易筛选二、质粒载体必须具备的基本条件 n具有复制起点，这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件n具有抗菌素抗性基因（选择标记基因），一种理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因（选择标记基因）n具有若干限制酶单一识别位点，插入外源DNA片段n具有较小的分子量和较高的拷贝数三、质粒载体常见的选择标记 培养基抗生素 质粒抗性基因四 常见不同类型的质粒载体1 高拷贝数的质粒载体n克隆目的：分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段nColE1、 pMB1和他们的派生质粒n分子量低、高拷贝数n没有蛋白质合成的情况下质粒DNA仍能继续复制n在培养基中加入适量的蛋白质合成抑制剂，如氯霉素，阻断了染色体DNA的复制，对质粒DNA复制无影响。经过1012小时的培养，每个细胞的质粒的拷贝数可达到10003000个2 低拷贝数质粒nF因子和pSC101的基础上发展n某种特定场合下的特殊用途，如克隆基因的产物含量过高时严重扰乱寄主细胞的新陈代谢，应选用低拷贝数质粒3 失控质粒载体n低拷贝质粒不能满足基因工程要求，选用失控质粒载体(Runaway plasmid vector)nUhlin (1979)首先发展的：pBEU1,pBEU2n30oC以下时，每个寄主细胞只有低拷贝数的质粒n培养温度超过35oC时，质粒的复制失去控制，每个细胞的拷贝数持续上升。最后，细胞的生长受到抑制，并失去存活能力，但是质粒DNA可累积到细胞总DNA的504 插入失活的质粒载体n将外源DNA片段插入在会导致抗性基因（如Tetr, ampr等）失活的位点，就可以通过抗菌素抗性的筛选，提高获得重组质粒的几率n目前，许多通用质粒载体都含有2个选择标记基因，在与外源DNA重组的过程中，一个选择基因保持完整，用作选择转化子，另一个插入失活，根据失活的效应进一步筛选出重组子，也就是带有外源DNA插入序列的重组质粒5 正选择的质粒载体外源DNA插入的重组质粒赋予寄主细胞一种新的表现型，通过直接选择这种表型特征可以获得重组的转化子6 表达型的质粒载体n人们的兴趣不再目的基因的本身，而是其编码的蛋白质产物n将克隆的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号的控制之下，能使外源基因在大肠杆菌中正常转录并翻译成相应的蛋白质的克隆载体成为表达载体典型的大肠杆菌表达型质粒载体7穿梭质粒载体n穿梭质粒载体(shuttle plasmid vector)，是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体五、几种重要的质粒克隆载体n通过集中重要质粒载体的介绍，了解载体的基本特性1pBR322质粒载体 n“P”表示它是一种质粒n“BR” 分别取自该质粒的两位主要构建者FBolivar和RLRodriguez姓氏的头一个字母n“322”系指实验编号，以与其它质粒载体如pBR325、pBR327及pBR328等相区别 pBR322质粒三个主要组成部分的来源：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因(ampr)；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(tetr)第三部分则来源于ColEl的派生质粒pMBl的DNA复制起点(ori) pBR322质粒载体的形体图2 pBR322质粒载体的优点n第一个优点是具有较小的分子量 ：4 363bp npBR322质粒DNA分子核苷酸的计数从EcoRI限制酶的识别位点开始，GAATTC中的第一个T为核苷酸1，然后沿着从tetr基因到ampr基因按顺时针方向顺序计数n易于纯化n连接较大的外源DNA片段 n第二个优点是，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号n24种核酸内切限制酶对pBR322 DNA分子都只具有单一的识别位点在9个（EcoRV、NheI、BamHI、SphI、Sail、XmalII、NruI、ClaI、HindIII）限制位点上插入外源DNA都会导致四环素抗性基因的失活 3种限制酶个位点(ScaI、PvuI和Pstl)插入外源DNA会导致氨苄青霉素抗性基因的失活质粒DNA编码的抗菌素抗性基因的插入失活效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法 n pBR322质粒载体的第三个优点是，具较高的拷贝数n每个细细胞中可累积积1000-3000个拷贝贝，这这就为为重组组体DNA的制备备提供了极大的方便 (3)pBR322质粒载体的改良 n迁移蛋白质(mob)基因作用位点的缺失 ，生物安全性：pBR327和pATl53 nEcoRI 插入失活位点：pBR324和pBR325 n提高拷贝数 ：pATl53 2 pUC质粒载体 n由美国加利福尼亚大学(University of California)的科学家JMessing和JVieria于1987年首先构建的(1) pUC载体的四个组成部分n来自pBR322质粒的复制起点(ori)n氨苄青霉素抗性基因(ampR)，但它的DNA核苷酸序列不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点 n大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因n位于lacZ基因中的靠近5端的一段多克隆位点(MCS)区段，但它并不破坏该基因的功能1234在lacZ序列内，具有一段相反取向的多克隆位点序列(MCS) ：Multiple cloning sitepUC18和pUC19质粒载体中多克隆位点图npUC质粒载体中的MCS区段，是一段特殊设计的具有许多种不同的核酸内切限制酶单识别位点的DNA短序列,位于lacZ基因中的靠近5 端 nLacZ基因编码的-肽链是半乳糖苷酶的氨基末端的短片段，它同失去了正常氨基末端的半乳糖苷酶突变体互补时，便会产出有功能活性的半乳糖苷酶分子n当pUC质粒载体转化了染色体基因组存在着此种半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞之后，便会出现具有功能活性的半乳糖苷酶的累积,于是，可以应用Xgal-IPTG显色技术检测转化子n任何插入到MCS的外源DNA片段，都会阻断-肽链的合成，因此含有重组质粒载体的克隆是无色的，含有非重组质粒载体的克隆形成蓝色-半乳糖苷酶 Xgal显色反应nX-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside)nX-gal 半乳糖 + 5-bromo-4-chloroindigon有活性功能的-半乳糖苷酶，四聚体形式-半乳糖苷酶n大肠杆菌，缺陷型的-半乳糖苷酶(M15多肽）npUC质粒，lac HindII片段（lac启动子+-肽链）nM15多肽 + -肽链 形