1.1研究意义原发性肝癌（HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、生存期短。我国是世界上HCC死亡率最高的国家，占世界上肝癌总死亡人数的53%。全球每年新患肝癌患者中约55%发生在我国，约有30多万人被诊断为HCC,且肝癌发病率和死亡率有逐年升高的趋势，因此，我国的肝癌诊治形势十分严峻M。目前乙肝病毒（HBV ）是公认的HCC主要诱因之一，HBV感染机体后能够引发慢性乙型肝炎（CHB ）,最终发展成为肝纤维化（LC ）和HCC。HBV编码的病毒蛋白在诱发肝癌形成过程中发挥了至关重要的作用，然而其分子机制不明。HBV编码病毒蛋白如何调控宿主基因的表达并在HBV致HCC中发挥的作用是目前研究的核心问题W。因此，揭示在HBV致HCC中发挥关键作用的因子，并探讨HBV病毒蛋白调控其表达的分子机制，将可能为HBV相关HCC治疗提供有效的干预靶点。在前期研究中，我们采用基因芯片筛选了整合HBV全基因组的HepG2.2.15细胞及其对照细胞HepG2的差异表达基因，发现IIA型磷脂酶A2 （ PLA2G2A ）的表达水平在HepG2.2.15细胞显著升高，并且采用RT- PCR和western blot对芯片结果进行了验证，血清学检测结果显示慢性乙肝患者PLA2G2A血清学水平较健康对照高。同时,证实了PLA2G2A能够促进HBV的复制（见工作基础）。由于PLA2G2A在肿瘤多种恶性生物学表型调控（增殖、恶性转化、血管生成、侵袭等）中发挥重要作用，我们进一步采用基因芯片筛选了 HBV相关肝癌组织及癌旁组织中差异表达基因，发现PLA2G2A的表达在癌组织显著上调;临床标本检测结果显示HBV相关肝癌组织中PLA2G2A表达较相应癌旁组织 高。然而，HBV是通过哪个病毒蛋白调控PLA2G2A的表达？其调节的信号通路如何？PLA2G2A又如何参与HBV相关肝癌的发生和发展？目前国内外还没有相关报道。本研究将阐明HBV病毒蛋白在转录水平调控PLA2G2A表达的分子机制及PLA2G2A对HBV致HCC形成及其恶性表型的影响。研究结果不仅有助于完善HBV调控宿主信号网络分子机理，同时为肝癌的临床诊断、潜在的分子靶向治疗及预后判断提供新的思路，1.2国内外研究现状及发展动态分析1.2.1 HBV是导致HCC形成的最主要因素全球超过20亿人感染HBV ,每年估计有32万人死于HBV相关疾病，大约有30-50%的HBV死于HCCM。临床研究表明：慢性HBV感染者的HCC发病危险性要比无HBV感染的普通人群高出200倍 我国肝癌病例80%以上是慢性乙肝患者。由此可见：HBV感染是引起HCC肝癌高发病率的主要危险因素。HBV病毒感染导致HCC的发生是一个多因 素、多阶段的复杂过程，主要包括宿主和病毒两方面的因素。如下图所示。HBV 感染诱发 HCC 的可能机理(Nat Rev Cancer. 2006 Sep;6(9):674-687 )1.2.2 HBV编码病毒蛋白在肝癌形成中的作用已知HBV基因组包含四个开放阅读框（ORF ）,编码七个病毒蛋白，包括：包膜蛋白基 因（preSl/HBx/S-ORF）编码的三个表面抗原（preSl,HBx,HBs ）;衣壳蛋白基因（preC/C-ORF ）编码的核心抗原（HBcAg ）和e抗原（HBeAg ）;聚合酶基因（P-ORF ）编码的带有反转录酶功能的聚合酶蛋白（HBp ）油X基因（X-ORF ）编码的X蛋白（HBx ）10HBV编码的病毒蛋白在肝癌的形成过程中发挥着重要作用。Chisari FV和Hildt E通过HBx、HBs转基因小鼠，发现在20个月内自发形成HCC ,充分证明了病毒蛋白在HCC形成中的重要作用队12;由于HBV转基因鼠天然免疫耐受，在不经历慢性炎症的情况下自发形成HCC ,首次提出了 HBV编码病毒蛋白能直接诱导HCC形成的假说HBx通过激活细胞生长信号通路，女 Wnt/beta-catenin和Ras/Raf/MAPK ,促进肝细胞恶性转化和増殖 ;HBs及其截短体蛋白在内质网堆积，导致内质网应激反应过度，形成氧自由基，致使基因组DNA不稳定，从而促进肝癌的形成；HBe通过抵抗TRAIL诱导的肝细胞凋亡，促逬肝细胞增殖17】。目前为止，HBV致HCC的机制还不是很清楚。因此，阐明HBV编码病毒蛋白如何调控宿主基因的表达及其在致HCC中发挥的作用将对于掲示HBV的致癌机理有着重要意义，同时也将为HCC的治疗提供新的干预靶点。1.2.3 IIA型磷脂酶A2的研究进展磷脂酶A2 （ PLA2）是一大的酶类，育g催化水解磯脂Sn-2位脂键，产生自由脂肪酸和溶血蹦旨，在脂类代谢及合成多种生物活性的物质如花生四烯酸、前列腺素、白三烯、血 栓素等生理病理过程中发挥重要作用，广泛参与了生物体内多种重要生理和病理过程。PLA2G2A是PLA2的成员之一属于分泌型蛋白其相对分子质量大小约为13kDa 15kDa ,由122个氨基酸残基组成，有7对二硫键，结构稳定。它广泛存在于哺乳动物的多种组织中，如肺、胸腺、肝、肾脏、前列腺、肠、胎盘、关节滑液和血液等。PLA2G2A与炎症反应、免疫反应、抗血栓形成、细胞増殖、缺血性损伤及变态反应密切相关近年来有研究表明，PLA2G2A与某些肿瘤的发生和发展有密切关系，如前列腺癌、消化道 肿瘤、肺癌和胃癌等，这引起了肿瘤研究领域的广泛关注吣iang等利用免疫组化的方法检测了 74例前列腺组纟只、79例前列腺上皮瘤变和78例前列腺癌中PLA2G2A的表达情况，发现前列腺癌和高分化的上皮瘤变中PLA2G2A表达高于低分化的上皮内瘤变和正常前列腺癌组织2()。Kashiwagi等采用Northern blot和免疫组化检测58例胰腺癌患者术后标本和正常对照PLA2G2A的表达情况，结果显示PLA2G2A在65%胰腺癌中高表达，而在正常组织中仅存在于部分腺泡和导管细胞中气在结直肠癌中，Avoranta等发现，PLA2G2A 在恶性结直肠肿瘤含量显著低于直肠腺瘤22。Dong等证实PLA2G2A在肺癌组织表达升高，且其表达水平与肿瘤分级及预后密切相关，PLA2G2A表达高的肺癌患者预后更差网。PLA2G2A可以刺激肿瘤细胞的生长，其产物花生四烯酸导致前列腺肿瘤细胞增殖，促进肿瘤血管生成和转移24。与之相反，PLA2G2A基因沉默的胃癌细胞的侵袭能力增强，且高表 达PLA2G2A的胃癌患者5年生存率明显提高以目前为止，PLA2G2A在肝癌发生和发展中的生物学功能尚未有研究。前期的工作中我们采用基因芯片筛选了慢性HBV患者肝癌组织及其相应癌旁组纟只的差异表达基因，发现PLA2G2A在癌组织中较癌旁组织高，提示PLA2G2A可能在HBV致HCC形成中发挥重要作用，然而，PLA2G2A在HBV相关癌组织中表达上调的机制及其在肝癌发生发展中的作用尚不清楚。HBV诱导的PLA2G2A表达是通过哪个病毒蛋白发挥作用？其调节机制如何？ PLA2G2A在HBV诱发肝癌发生和发展过程中如何发挥作用？尚待进一步研究1.3本课题的假设综合分析我们前期工作发现:HBV能够上调PLA2G2A的表达，慢性乙肝患者PLA2G2A血清学水平较健康对照高，PLA2G2A促进HBV的复制;HBV相关肝癌组织中PLA2G2A表达显著高于癌旁；PLA2G2A促进细胞集落的形成，提示PLA2G2A可能参与了 HBV致HCC的形成(见工作基础部分)。根据以上初步实验结果，不难发现一个非常有趣的相互关系网即:HBV感染引起好细胞内异常表达某些特定细胞因子和胞内蛋白如PLA2G2A等，而这些特定蛋白与肝癌的形成和发展存在一定相关性，并且其中一些蛋白(如PLA2G2A )的异常表达又会促进HBV在细胞内的复制水平，两者形成一种正反溃调节关系。如下I与此类似的两个或多个因子正反馈调节促进组织生长或疾病发生已有报道。Ansel等于200年提出了著名的淋巴滤泡生成正反馈调节假说认为：BLC ( B-lymphocytechemoattractant)与membreane lymphotoxin al2正反馈促进淋巴滤泡生成和成熟【27】。因此，我们根据B有理论和初步实验结果，提出了 HBV感染与PLA2G2A异常表达之间这种正反馈调节诱发HCC的假说:HBV可能通过诱导某些细胞因子和蛋白(如PLA2G2A )的异常表达来参与肝细胞多种恶性生物学表型的调控，而PLA2G2A的异常表达又将促进HBV在肝细胞内的复制Ph这种正反馈调节可能是HBV诱发HCC的机制之一。1.4本项目相关研究在前期工作基础上，本课题拟：通过ELISA ,免疫组化、RT-PCR和western blot等实验检测PLA2G2A在HBV相关疾病中的表达，分析其与疾病进程，病理分期和预后的相关性；通过截短和定点突变的萤光素酶报告基因实验、凝胶电泳迁移实验(EMSA )、染色质免疫共沉淀(CHIP)实验等检测病毒蛋白激活的信号转导途径和诱导入核的转录因子，探讨HBV病毒蛋白在转录水平诱导PLA2G2A表达的分子机制；通过流式细胞仪分析转染PLA2G2A真核表达载体后细胞周期的影响，检测PLA2G2A超表达对肝细胞的转化能力。研究结果不仅有助于完善HBV调控宿主信号网络分子机理，同时也为临床诊断和治疗乙肝相关肝癌及预后监测提供全新的思路。参考文献1. Chen C, Wang G. Mechanisms of hepatocellular carcinoma and challenges andopportunities for molecular targeted therapy. World J Hepatol. 2015,7(15):1964-70.2. Deng GL, Zeng S, Shen H. Chemotherapy and target therapy for hepatocellularcarcinoma: New advances and challenges. World J Hepatol. 2015, 7(5):787-98.3. El-Serag HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma.Gastroenterology. 2012, 142(6):1264-73.4. Papatheodoridis GV, Chan HL, Hansen BE, et al. Risk of hepatocellular carcinomain chronic hepatitis B: assessment and modification with current antiviral therapy. JHepatol. 2015, 2(4):956-67.5. Zeng Z. Human genes involved in hepatitis B virus infection. World JGastroenterol. 2014, 20(24):7696-706.6. He HL, Lee YE, Shiue YL, et al. PLA2G2A overexpression is associated with poortherapeutic response and inferior outcome in rectal canc