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脑脊液环介导等温扩增和GeneXpertMTB/RIF在结核性脑膜炎早期诊断中的效能分析 樊丽超 陈宇 朱雅娟 曹宏丽摘要 目的 分析和比較脑脊液环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和GeneXpert MTB/RIF(简称GeneXpert)在结核性脑膜炎早期诊断中的效能。 方法 选取沈阳市胸科医院2018年6月2019年6月疑诊结核性脑膜炎的患者189例,采集患者抗结核治疗前的脑脊液标本分别进行液体培养(MGIT)、LAMP和GeneXpert检测。以液体培养法(MGIT)为标准,计算2种检测技术在结核性脑膜炎诊断中的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率、Kappa值。 结果 LAMP的敏感度为79.6%,特异度为94.3%,阳性预测值为83.0%,阴性预测值93.0%,一致率90.5%,Kappa值=0.749。GeneXpert的敏感度为98.0%,特异度为88.6%,阳性预测值为75.0%,阴性预测值为99.2%,一致率为91.0%,Kappa值=0.787。 结论 LAMP和GeneXpert对结核性脑膜炎检测的灵敏度较液体培养(MGIT)明显提高,可以在一定程度上提高临床医生对疑似结核性脑膜炎患者的诊治能力,值得在基层结核病院实验室广泛推广。关键词 结核性脑膜炎;脑脊液;环介导等温扩增 R529.3 B 1673-9701(2020)17-0128-04Effectiveness analysis of CSF loop-mediated isothermal amplification and GeneXpert MTB/RIF in the early diagnosis of tuberculous meningitisFAN Lichao CHEN Yu ZHU Yajuan CAO HongliDepartment of Tuberculosis, the Tenth Peoples Hospital of Shenyang(Shenyang Chest Hospital), Shenyang 110044, ChinaAbstract Objective To analyze and compare the efficacy of cerebrospinal fluid loop-mediated isothermal amplification(LAMP) and GeneXpert MTB/RIF(GeneXpert) in the early diagnosis of tuberculous meningitis. Methods A total of 189 patients with suspected tuberculous meningitis from Shenyang Chest Hospital from June 2018 to June 2019 were selected. Cerebrospinal fluid samples from patients before antituberculosis treatment were collected for mycobacterium growth indicator tube(MGIT), LAMP, and GeneXpert tests. Using the mycobacterium growth indicator tube(MGIT) as the standard, the sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, agreement rate, and Kappa value of the two detection techniques in the diagnosis of tuberculous meningitis were calculated. Results The sensitivity of LAMP was 79.6%, the specificity was 94.3%, the positive predictive value was 83.0%, the negative predictive value was 93.0%, the agreement rate was 90.5%, and the Kappa value was 0.749. The sensitivity of GeneXpert was 98.0%, the specificity was 88.6%, the positive predictive value was 75.0%, the negative predictive value was 99.2%, the agreement rate was 91.0%, and the Kappa value of 0.787. Conclusion The LAMP and GeneXpert in the detection of tuberculous meningitis have significantly higher sensitivity than that of mycobacterium growth indicator tube(MGIT), which can improve the diagnosis and treatment ability of clinicians to patients with suspected tuberculous meningitis. It is worthy of widespread promotion in the laboratory of primary tuberculosis hospital.Key words Tuberculous meningitis; Cerebrospinal fluid; Loop-mediated isothermal amplification结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是脑膜非化脓性炎症,多数由结核分枝杆菌经血液循环或直接途径侵入蛛网膜下间隙而引起,是结核病中最严重的类型之一,该病发病急缓不定,但病程都较长,致残率和死亡率高,故早期诊断和尽早合理规范的治疗,对改善患者的预后,降低后遗症的发病率至关重要1。传统的TBM诊断金标准为脑脊液抗酸染色阳性或脑脊液结核菌培养阳性,但抗酸染色阳性率极低,结核菌培养耗时长,对TBM的早期诊断价值有限。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是可以检测结核分枝杆菌的一种新型的恒温核酸扩增技术,该方法操作简单,报告快速,不需要昂贵的仪器设备,比较适合在基层实验室推广应用2。而GeneXpert MTB/RIF(简称GeneXpert)是一种新的利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术,目前在肺结核的检测中敏感度和特异度较高,并且可用于脑脊液的检测3,本文对沈阳市胸科医院收治的189例疑诊TBM的患者进行了脑脊液LAMP和脑脊液GeneXpert检测,以脑脊液液体培养(MGIT)为金标准,评价两种检测手段检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度,探讨其对结核性脑膜炎的诊断价值。1 对象与方法1.1 研究对象选取2018年6月2019年6月沈阳市胸科医院结核七病区疑诊TBM的患者189例,采集患者抗结核治疗前的脑脊液标本分别进行液体培养(MGIT)、LAMP和GeneXpert检测。1.2 研究方法1.2.1 脑脊液的采集和检测 所有患者均取入院后第一次腰穿脑脊液3 mL,标本采集前患者或家属均签署用于本次临床试验采取标本的知情同意书。所有实验部分均由沈陽市胸科医院结核病实验室完成。1.2.2 MGIT液体培养 收集患者抗结核治疗前的脑脊液,经4%NaOH溶液处理,取0.1 mL接种于酸性罗氏培养基,置于37恒温培养箱培养,MGIT960液体培养系统由美国BD公司生产,将脑脊液标本按照BACTECTM MGIT生产规范(MGITTM Procedure Manual)要求进行培养4。1.2.3 LAMP法 收集患者抗结核治疗前的脑脊液,采用荧光目测试剂盒荣研生物科技(中国)有限公司,脑脊液吸入吸附剂试管中混匀裂解(90,5 min)。将吸附管装到样本处理管上,摇晃510次后提取核酸,加上滴注盖,轻压样本处理管将样本滴入反应管中。充分混合后进行LAMP反应,于67反应40 min,然后放入恒温荧光核酸扩增LF-160的荧光目视检测单元,通过紫外线激发荧光观察反应结果5。1.2.4 GeneXpert GeneXpert检测仪及试剂盒由美国Cepheid公司生产,具体操作按照说明书进行。收集患者抗结核治疗前的脑脊液,向1 mL脑脊液中加入1 mL样本处理充分混匀,放置15 min并间断摇晃,然后用无菌吸管将2 mL液体移入塑料试剂盒中,后者插入GeneXpert检测平台中,输入样品相关信息后运行仪器会自动进行样品的过滤和洗涤,超声溶菌释放出DNA后与PCR反应试剂混合,半巢式实时扩增并检测荧光信号,根据循环阈值的高(CT16)、中(16ct22)、低(22ct28)的判定标准,2 h后仪器自动给出检测结果6。1.3 统计学分析用SPSS20.0软件进行统计分析,计算LAMP和GeneXpert的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率和Kappa值。2 结果2.1 脑脊液LAMP检测结果及脑脊液GeneXpert检测结果将189例患者的脑脊液标本进行液体培养(MGIT)、LAMP和GeneXpert检测,液体培养阳性49例(25.93%),LAMP阳性47例(24.87%),GeneXpert阳性64例(33.86%)(表1、2)。2.2 以液体培养检测结果为标准判断LAMP和GeneXpert检测技术的诊断效能以液体培养结果为标准,LAMP的敏感度为79.6%,特异度为94.3%,阳性预测值为83.0%,阴性预测值93.0%,一致率90.5%,Kappa值=0.749,说明两者一致性较好。以液体培养结果为标准,GeneXpert的敏感度为98.0%,特异度为88.6%,阳性预测值为75.0%,阴性预测值为99.2%,一致率为91.0%,Kappa值=0.787,说明两者一致性较好(表3)。3讨论TBM是结核病最严重的类型之一,据统计,2017年全世界有1000万人罹患结核,其中每年估计有10多万例TBM新病例。面对如此严峻的疫情,TBM的诊断和治疗情况却不是很乐观,因为TBM的临床症状不典型,脑脊液载菌量低,导致病原学诊断率很低7。有文献报道,早期确诊的结核性脑膜炎病死率低于10%,而晚期确诊的结核性脑膜炎病死率高达60%以上8。因此早期诊断对TBM患者至关重要,LAMP和GeneXpert等新的诊断技术的出现,有望提高结核性脑膜炎的早期诊断效率,以改善TBM患者的预后,提高治愈率,降低致残率和死亡率。本研究中脑脊液LAMP法检测的敏感度为79.6%,特异度为94.3%,阳性预测值为83.0%,阴性预测值93.0%,一致率90.5%,Kappa值=0.749,说明两者一致性较好。因此可认为LAMP的检测结果接近液体培养(MGIT)结果,且比液体培养(MGIT)可检测出更多的病原学阳性患者。刘洋等9
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