一、基因工程的操作步骤： 目的基因的获取； 形成重组DNA分子； 重组DNA 导入受体细胞； 筛选含有目的基因的受体细胞； 目的基因表达。第一页，共41页。1.第一步：目的基因的获取（1）方法： 从基因文库中获取目的基因 利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因（目的基因的序列已知） 化学方法合成目的基因（目的基因的序列已知）第二页，共41页。 从基因文库中获取目的基因用限制酶切用限制酶切成许多片断成许多片断 将含有某种生物不同基因将含有某种生物不同基因的许多的许多DNADNA片断，导入受体片断，导入受体菌的群体储存，各个受体菌菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的分别含有这种生物的不同的基因，称为基因，称为基因文库。第三页，共41页。 利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。第四页，共41页。n n聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR技术）技术）n n变性：变性：双链双链DNADNA解链解链成为单链成为单链DNADNAn n复性（退火）复性（退火）：部分部分引物与模板的单链引物与模板的单链DNADNA的特定互补部位的特定互补部位相配对和结合相配对和结合n n延伸：延伸：以目的基因为以目的基因为模板，合成互补的新模板，合成互补的新DNADNA链链第五页，共41页。双链DNA1.变性升温至95单链DNA2.复性降温至60引物与母链结合3.延伸升温至72DNA聚合酶解旋PCR技术与原理Taq DNA聚合酶有耐高温的特点第六页，共41页。思考：PCR技术扩增目的基因，需要什么前提和条件？过程如何？原理是什么？聚合酶链式反应(PCR技术)扩增原理：目的：前提：条件：DNA复制获得大量的目的基因有一段已知目的基因（两端）的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。模板DNA（目的基因）耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)四种脱氧核苷酸两种DNA引物第七页，共41页。人工合成基因的方法人工合成基因的方法反转录法反转录法根据已知的氨基酸序列合根据已知的氨基酸序列合成成DNADNA化学方法合成目的基因第八页，共41页。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成双链双链DNADNA( (即目的基因即目的基因) )反转录反转录合成合成目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNA(cDNA)DNA(cDNA)化学方法合成目的基因通过化学合成的目的基因是否通过化学合成的目的基因是否含有粘性末端？含有粘性末端？第九页，共41页。大片段DNA打成许多小片段小片段DNA目的基因载入运载体细菌重组DNA分子重组DNA分子例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因如果运气不好，在打成小片段时，有可能把抗虫基因打断基因组文库第十页，共41页。如何从基因文库中获取目的基因?大片段DNA打成许多小片段小片段DNA目的基因载入运载体细菌重组DNA分子重组DNA分子基因组文库对基因组文库的所有细菌进行逐一筛查找出有抗虫蛋白的菌落该菌落所携带的基因片段就含有目的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因容易吗？第十一页，共41页。 2、形成重组DNA分子（构建基因表达载体)基因表达载体的组成启动子目的基因终止子复制起点标记基因通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同的粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子（基因表达载体）。第十二页，共41页。3、将重组DNA导入受体细胞转化 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。第十三页，共41页。1.将重组DNA导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法2.将重组DNA导入动物细胞显微注射技术（最多、最有效）3.将重组DNA导入微生物细胞Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。第十四页，共41页。（1）将重组DNA导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法第十五页，共41页。（2）将重组DNA导入动物细胞显微注射技术提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵受精卵移植第十六页，共41页。重组质粒大肠杆菌的拟核目的基因氨苄青霉素抗性基因（标记基因）将细菌用CaCl2处理，使细胞处于感受态，可促进细胞吸收DNA分子（3）如果是导入微生物（如细菌）第十七页，共41页。 感受态：细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。 处于感受态的细胞称为感受态细胞.CaClCaCl2 20重组载体重组载体感受态细胞感受态细胞42第十八页，共41页。抗氨苄青霉素基因点为目的基因与质粒A的结合点四环素抗性基因目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。第十九页，共41页。vv 4. 4.筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记：目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记： 如以质粒做为载体可进行抗性的检测如以质粒做为载体可进行抗性的检测原理：质粒上有抗生素的抗性基因方法：利用选择培养基筛选第二十页，共41页。思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？第二十一页，共41页。没有质粒含目的基因的质粒正常质粒第二十二页，共41页。没有质粒含目的基因的质粒正常质粒第二十三页，共41页。检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因（关键）检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）（2）常用的技术：DNA分子杂交技术蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交5. 目的基因的表达（1）内容：第二十四页，共41页。（2）基因工程的的原理及技术分子水平：DNA分子杂交技术核心DNA探针目的基因的脱氧核苷酸（单链）序列片段用荧光分子或放射性同位素标记看能否形成杂合的双链区第二十五页，共41页。检测鉴定检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定等过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNAB.用含目的基因的DNA片段( 单链)用放射性同位素等作标记,以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中方法: DNA分子杂交方法: 分 子 杂 交方法: 抗原抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA.第二十六页，共41页。目的基因与质粒的连接第二十七页，共41页。 基因DNA文库的构建 将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，感染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因文库。第二十八页，共41页。基因探针：基因探针： 基因探针就是一段与目的基因或基因探针就是一段与目的基因或DNADNA互补的互补的特异特异核苷酸序列。核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分它包括整个基因，或基因的一部分；可以是；可以是DNADNA本身，也可以是由之转录而来的本身，也可以是由之转录而来的RNARNA。第二十九页，共41页。DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 第三十页，共41页。基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无杂交带第三十一页，共41页。 传统的遗传育种方法有哪些？ 传统的遗传育种方法能否解决不同种生物优良性状的重组问题？ 基因工程技术如何解决不同种生物优良性状的重组问题？基因工程的应用第三十二页，共41页。基因工程的应用一、基因工程与作物育种二、基因工程与疾病治疗（）基因工程药物（2）基因诊断（3）基因治疗三、 基因工程与环境保护第三十三页，共41页。基因工程的应用一、基因工程与作物育种1.抗虫转基因植物2.抗病转基因植物3.其他抗逆转基因植物（如抗盐、抗旱、抗除草剂植物等）4.利用转基因改良植物的品质基因工程在农业上的应用：1）高产、稳产和具优良品质的品种2）抗逆性品种基因工程在畜牧基因工程在畜牧养殖业上的应用养殖业上的应用: :第三十四页，共41页。基因工程与疾病治疗 基因工程药品的生产 在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生物体的在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生物体的哪些结构中提取？哪些结构中提取？药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。 传统生产方法的缺点传统生产方法的缺点由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。 可利用什么方法来解决上述问题？可利用什么方法来解决上述问题？ 利用基因工程方法制造利用基因工程方法制造“ “工程菌工程菌” ”，可高效率地生产出各种高，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。质量、低成本的药品。第三十五页，共41页。基因工程胰岛素 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。胰岛素分子结构胰岛素分子结构第三十六页，共41页。基因工程胰岛素 将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!胰岛素生产车间胰岛素生产车间第三十七页，共41页。基因工程干扰素 干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。干扰素生产车间干扰素生产车间干扰素分子结构干扰素分子结构第三十八页，共41页。SCID的基因工程治疗 重症联合免疫缺陷（SCID）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称ADA）的基因（ada）发生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。SCIDSCID患者生存在无菌环境中患者生存在无菌环境中第三十九页，共41页。基因治疗SCID的过程第四十页，共41页。基因工程与生态环境保护 基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的育成功的“ “超级细菌超级细菌” ”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDTDDT等毒害物质。等毒害物质。第四十一页，共41页。