高级生化高级生化(shnhu)(shnhu)技术技术中山医学院中山医学院生物化学生物化学(shn w hu xu)(shn w hu xu)与分子生物学与分子生物学教研室教研室钱艳Email：第一页，共三十八页。实验(shyn)二 PCRPCR试剂盒检测试剂盒检测HBV HBV DNADNA第二页，共三十八页。实验分组，认清试剂（每2人做一管，2阳性(yngxng)管）患者血清40l+40lDNA提取液，混匀沸水浴10min，10000rpm5min（离心机的使用）取上清2l（或阳性血清2l）加入一PCR反应管6000rpm5s，混匀一、实验(shyn)操作及注意事项第三页，共三十八页。933min预变性(HemaPCR仪的使用与程序设计)9345s，5535s，7260s重复(chngf)25个循环72保温5min，-20保存备用第四页，共三十八页。二、二、PCRPCR基本原理及相关基本原理及相关(xinggun)(xinggun)知知识识n n 概念概念 聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerasepolymerasechainchainreactionreaction，PCRPCR）是一种体外扩增特异）是一种体外扩增特异DNADNA片断的技片断的技术术, ,能在短时间内获得数百万个特异能在短时间内获得数百万个特异DNADNA序列序列(xli)(xli)的拷贝。的拷贝。第五页，共三十八页。Kary Mullisl PCR技术最早由美国 Cetus公司人类(rnli)遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的。l Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。 第六页，共三十八页。 相对相对DNADNA克隆而言，这种方法的特点：操作简克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强； 广泛的应用于医学诊断、分子广泛的应用于医学诊断、分子(fnz)(fnz)生物学、分生物学、分子子(fnz)(fnz)克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。域。第七页，共三十八页。n n PCRPCR扩增扩增DNADNA片段片段(pindun)(pindun)的原理的原理 PCRPCR是在模板是在模板DNADNA、引物和四中脱氧核苷酸、引物和四中脱氧核苷酸等存在的情况下，等存在的情况下，DNADNA聚合酶依赖聚合酶依赖(yli)(yli)的酶促合的酶促合成反应，整个扩增过程分三步：成反应，整个扩增过程分三步：第八页，共三十八页。 变性：加热，模板变性：加热，模板DNADNA形成两条单链形成两条单链 退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链DNADNA与引物配对结合与引物配对结合 延伸：在延伸：在DNADNA聚合酶及镁离子等存在的条件聚合酶及镁离子等存在的条件(tiojin)(tiojin)下下，引物，引物3-3-端向前延伸，合成与模板配对的新链端向前延伸，合成与模板配对的新链第九页，共三十八页。 上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环DNADNA量量增加一倍。新合成的链又可以增加一倍。新合成的链又可以(ky)(ky)成为新一轮循环成为新一轮循环的模板，经过的模板，经过25-3025-30个循环后目的个循环后目的DNADNA就可以扩增就可以扩增10106 610109 9倍。倍。通过循环可以提高通过循环可以提高PCRPCR的特异性。的特异性。第十页，共三十八页。第十一页，共三十八页。n nPCRPCR反应反应(fnyng)(fnyng)体系的组成及功能体系的组成及功能 PCR PCR的完成是在一个的完成是在一个0.5ml0.5ml的的EPEP管中完成，一个完整管中完成，一个完整的的PCRPCR反应体系应包括以下成分反应体系应包括以下成分： 模板模板(mbn)(mbn) 单、双链单、双链DNADNA均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNA结合蛋白类。结合蛋白类。相对相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCRPCR对对DNADNA模板纯度的模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，一般认为要求并不严格。模板用量也是很低的，一般认为102104102104拷贝模拷贝模板就可以满足要求。板就可以满足要求。 一般一般100ng DNA100ng DNA模板模板/100/100 L L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。第十二页，共三十八页。 引物：是预扩增引物：是预扩增DNADNA片段片段(pin dun)(pin dun)两端的已知序列，是保证两端的已知序列，是保证 PCRPCR特异性的关键因素，特异性的关键因素， 引物浓度：引物浓度：0.1-0.50.1-0.5 mol/Lmol/L浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配, ,反应特异性下降。反应特异性下降。第十三页，共三十八页。 TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶有良好的热稳定性，具有有良好的热稳定性，具有5-35-3聚合酶活性和聚合酶活性和3-53-5外切酶外切酶活性，因此。它对核苷酸的错配是没有校正功活性，因此。它对核苷酸的错配是没有校正功能。能。其活性对其活性对MgMg2+2+浓度非常浓度非常(fichng)(fichng)敏感敏感终浓度一般为：终浓度一般为：2.5u/100ul2.5u/100ul，酶量增加使反应特异性下酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。降；酶量过少影响反应产量。 dNTPdNTP： 已有商品化的混合液，终浓度一般为已有商品化的混合液，终浓度一般为20200umol/L20200umol/L。第十四页，共三十八页。yy1010PCRPCR反应反应bufferbuffer：已作成商品化的产品已作成商品化的产品(chnpn)(chnpn)，它包括：，它包括：250500mmol/LKCl250500mmol/LKCl； 100500mmol/LTris-HAC100500mmol/LTris-HAC（pH8.4pH8.4）；）；1520mmol/L1520mmol/LMgClMgCl2 2（对（对TaqTaq酶的活性影响很大，一般浓度为酶的活性影响很大，一般浓度为1.52.0mmol/L1.52.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调，实际应用时根据反应体系的情况进行调整。）；整。）； 0.1%0.1%明胶或牛血清白蛋白明胶或牛血清白蛋白第十五页，共三十八页。 ddHddH2 2OO调节调节(tioji)(tioji)反应体积反应体积 液体石蜡油液体石蜡油第十六页，共三十八页。n n 影响影响(yngxing)(yngxing)PCRPCR的主要因素的主要因素 PCRPCR反应体系的各个组分反应体系的各个组分 PCRPCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）循环的温度（预变性、变性、退火、延伸） PCRPCR循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应 操作环境操作环境 第十七页，共三十八页。平台(pngti)效应及其原因第十八页，共三十八页。 实验三 核酸和蛋白(dnbi)紫外分光光度法定量测定第十九页，共三十八页。分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行(jnxng)定性、定量分析的实验技术。一、分光(fnun)光度技术第二十页，共三十八页。光学(gungxu)光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外 远红外（真空紫外）10nm200nm200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m第二十一页，共三十八页。电磁波谱氢灯复合(fh)光(阳光及钨灯)发射光谱(fshunp)红橙黄绿青蓝紫单色光三棱镜可见光分光(fnun)光度计光源紫外分光光度计光源高低第二十二页，共三十八页。二、有关(yugun)光学原理1.吸收光谱在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，光源发射光谱(fshunp)中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。第二十三页，共三十八页。透射光透射光入射光入射光反射光反射光被物质吸收的光被物质吸收的光第二十四页，共三十八页。光吸收基本定律: Lambert-Beer定律(dngl)A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxI I-dIs朗伯定律(dngl)(1760) A=lg(I0/It)=k1b比尔定律(dngl)(1852)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介质厚度(cm)第二十五页，共三十八页。Lambert-Beer定律(dngl)DKCL吸光度摩尔消光系数吸收物质的光径（cm）溶液浓度（mol/L）第二十六页，共三十八页。722型分光(fn un)光度计结构方框图光源(gungyun)吸收(xshu)池检测系统分光系统第二十七页，共三十八页。利用分光光度法对物质进行定量测定(cdng)的方法。（一）标准曲线法（二）标准管法三.分光(fn un)光度法在生物化学中的应用第二十八页，共三十八页。（一）标准曲线法配置浓度递增的标准溶液（C），在最大吸收波长（max）处测得各个吸光度（A），绘制标准曲线（A-C曲线）。在测定(cdng)被测样品时，以相同条件在max处测定A值，从标准曲线上查得该样品相应的浓度。分光光度法在生物化学(shn w hu xu)中的应用第二十九页，共三十八页。01234mg/mlA。*0.80.60.40.20溶液(rngy)浓度的测定A bc工作(gngzu)曲线法(校准曲线)朗伯-比尔定律的分析(fnx)应用第三十页，共三十八页。（二）标准管法在相同条件下测定(cdng)已知浓度（C标）标准溶液的吸光度（A标），同时测定未知浓度（C样）样品溶液的吸光度（A样），根据Lambert-Beer定律：A标=K标C标L标A样=K样C样L样分光(fn un)光度法在生物化学中的应用第三十一页，共三十八页。样品与标准物质成分相同(xintn)K标=K样比色皿规格相同L标=L样/：A标/A样=C标/C样C样=(A样/A标)C标三.分光(fn un)光度法在生物化学中的应用第三十二页，共三十八页。紫外吸收(xshu)法原理：共轭双键优点(yudin)：简单、快速、灵敏、样品可以回收缺点：有一定的误差（原因）；受核酸类物质干扰第三十三页，共三十八页。结果分析(fnx)： 浓度分析： 光径1cm，以溶解蛋白的缓冲液为对照A280=1.0对应蛋白质的浓度为1.0mg/ml 蛋白质浓度（mg/ml） =1.45A280-0.74A260第三十四页，共三十八页。用分光光度计法定量DNA1. 取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);2. 蒸馏水作为空白,在波长(bchng)260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。第三十五页，共三十八页。3.加入DNA稀释液，测定260nm及280nm的吸收值。260nm读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g /ml双链DNA，33g /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般(ybn)DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。第三十六页，共三十八页。4. 记录OD值，通过计算确定DNA浓度(nngd)或纯度，公式如下:dsDNA=50(OD260)稀释倍数以上浓度单位为g/ml第三十七页，共三十八页。内容(nirng)总结高级生化技术。Email：。72保温5min，-20保存备用。上述三步为一个循环，经过 一个循环DNA量增加一倍。模板用量也是很低的，一般认为 102104拷贝模板就可以满足要求。PCR反应体系的各个组分。PCR循环的次数和平台效应。操作(cozu)环境