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单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*1植物基因组DNA的提取及纯度与含量的测定实验八第一部分植物基因组DNA的提取一、实验目的和要求1、学习并掌握植物基因组DNA的提取原理和方法;2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作;3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA结果的初步分析。DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷,它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭(EB)染色后,在紫外光下可见橙红色带,并可确定DNA片断在凝胶中的位置。影响DNA泳动速率(迁移率)的因素有:DNA分子质量的影响:双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分子量越大,迁移率越小。DNA构型的影响:超螺旋DNA线状DNA开环DNA胶浓度的影响:浓度越低,相同核酸分子迁移越快,一般常用的凝胶浓度为12;电场强度的影响:电场强度愈大,带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,(一般5V/cm)(电场强度)。而对于大片段电泳,甚至用0.51.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时,只能使用聚丙烯酰胺凝胶。EB的影响:溴化乙锭(EB)插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统,但它们各有利弊。TAE价格低廉,但缓冲能力低,必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时,会使DNA污染磷酸盐,影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA,可以鳌合二价离子,抑制DNase,保护DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性,此时核酸分子带负电,向正极移动。碱基组成与电泳温度的影响:一般影响不大在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题:(1)DNA的二级结构和双链易受多种因素(如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等)的影响引起双链解开,即“变性”,因此抽提时避免使用变性的条件。(2)抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀,它能把大分子的DNA切成碎片,所以要加以杜绝,现可以通过多种途径来做到这一点:a、低温操作;b、调节pH,使偏碱(pH8.0);c、抽提液中加表面活性剂;d、加螯合剂(EDTA)除去酶的铺助因子(Mg2+),使酶活性丧失。(3)防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素,会使DNA降解,一般综合考虑,取pH8.0左右为宜。(4)防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等,DNA分子特别大,极易被机械张力拉断,甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂,所以在抽提过程中要特别注意这一点,操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数,也不要剧烈摇动。(5)植物的次生代谢物(主要是胞质内的多酚类或色素类化合物)对核酸提取有干扰作用。因此,一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料,这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少,DNA含量高,且易于破碎,植物材料最好是新鲜的。三、实验材料与试剂1、实验材料:植物幼嫩叶子2、实验试剂(1)基因组DNA提取缓冲液(2)氯仿:异戊醇:乙醇抽提液(3)TE缓冲液(4)平衡酚:(5)RNA酶A(6)酚/氯仿(7)氯仿/异戊醇(8)异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。(9)3mol/LNaAc(10)5TBE缓冲液(11)6电泳上样缓冲液(12)1.0%琼脂糖凝胶(13)EB(14)DNA分子量Markers:125,564,2027,2322,4361,6557,9416,23130bp.四、实验器材与仪器1、研体2、离心机、离心管(7ml)及离心管架;3、微量移液器:10ul、1000ul;4、恒温水浴箱655、制冰机;6、冰箱;7、恒温水浴箱37;8、微波炉;9、电泳仪及电泳槽;10、紫外检测仪。五、实验操作方法和步骤置于预热到65的研体中,加少许石英砂;加入预热到65的核酸提取缓冲液3ml称取植物幼嫩叶子0.5g迅速研成匀浆转移到7ml带盖离心管中65水浴保温40min,其间经常轻柔摇动加入3ml氯仿-异戊醇溶液轻柔颠倒混匀后,室温静置分层5min离心12000rpm5min上清液转移到干净7ml离心管中,记录体积,弃沉淀,*加入等体积异丙醇试剂,混和后静置20min沉淀DNA4离心5,000g3min收集絮状沉淀加入3mlTE,65水浴中助溶15min,使之完全溶解加入等体积的平衡酚,轻柔颠倒混匀,室静置10min4离心12,000rpm10min转移上清于新7ml离心管中,记录体积*加入等体积的酚氯仿,轻柔颠倒混匀,室温放置15min4离心(12,000rpm,5min)吸取上清转移到一新7ml离心管中,记录体积*加入等体积的氯仿,颠倒混匀,室温放置5min4离心(12,000rpm,10min)吸取上清转移到一新7ml离心管中,记录体积*加入1/10体积3mol/LNaAC和2体积20预冷的无水乙醇20放置20min*4离心(12,000rpm,10min)收集沉淀*用70%乙醇洗涤沉淀,倾倒掉乙醇溶液,干燥,让酒精完全挥发用1ml TE溶解沉淀,加入5l RNase(5g/l),37 保温10 min,即为植物基因组DNA溶液*凝胶电泳检测基因组DNA(分子量大小、纯度)说明:如果蛋白质和RNA未去除干净,重复酚,酚/氯仿,氯仿抽提步骤,继续用RNase 处理,乙醇沉淀和洗涤,重溶于TE中,直至基因组DNA纯度和质量符合要求。(一) 植物基因组DNA的提取 紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量*植物基因组DNA的提取操作过程现象*植物基因组DNA的提取操作过程现象1、制胶(1琼脂糖凝胶)在胶模上架好梳子。称取01g琼脂糖,置于250ml锥形瓶中,加100ml0.5TBE电泳缓冲液,加热熔化至无颗粒状琼脂糖,待其冷却至5060后,加入EB,使其终浓度为0.5mg/L,摇匀后立即倒入准备好的胶模中,待胶凝固后,放入电泳槽中,倒入适量0.5TBE(刚好淹过胶面),拔去梳子备用。(注:EB为诱变剂、致癌物,接触凝胶必须戴手套操作)2、加样取5ul纯化的DNA原溶液样品,与1ul6电泳加样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中(注:勿划破或戳穿加样孔,勿带入气泡)。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。3、电泳加完样后,盖上电泳槽盖,立即接通电源,使电压调到100V,恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时,停止电泳(约需3060min)。4、观察和拍照取出胶块置于紫外灯下观察,DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带,再用成像仪进行拍照,以便于分析。(注:紫外光对眼睛有害,观察时戴上防护镜或眼镜,或隔着玻璃或有机玻璃观察)。(二)琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA第二部分基因组DNA纯度与含量的测定一、实验目的和要求1、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法;2、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量的方法。二、实验基本原理核酸DNA和RNA所含碱基的苯环结构(嘌呤环和嘧啶环)的共轭双键具有紫外吸收的性质,它们在260nm处有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波长进行核酸含量的测定。波长为260nm时,DNA或RNA的光密度的大小不仅与总含量有关,也与它们的不同构型而有差异。对标准样品来说,浓度为1g/ml时,DNA钠盐的OD2600.02。当OD2601时,双链DNA含量约为50g / ml单链DNA含量约为37g/mlRNA含量约为40g/ml寡核苷酸含量约为30g/ml(由于底物不同有差异)1、核酸样品DNA、RNA含量的测定:如用1cm光径石英比色皿,用H2O稀释DNA或RNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前DNA的含量:DNA(g/l)=50OD260读数DNA样品稀释倍数/1000RNA(g/l)=40OD260读数RNA样品稀释倍数/1000若样品不纯,则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量,可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时,会影响DNA吸光度的准确测定。由于DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处。所以,一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230,计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。2、核酸样品纯度判断的一般标准:DNA纯度:OD260/OD2801.8,表示为纯的DNA;OD260/OD2801.9,表示有RNA污染;OD260/OD2801.6,表示有蛋白质、酚等污染。RNA纯度:1.7OD260/OD2802.0,表示为纯的RNA;OD260/OD2801.7时,表示有蛋白质或酚污染;OD260/OD2802.0时,表示可能有异硫氰酸残存。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。若样品不纯,则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量;同时也会影响酶切和PCR的效果。三、实验材料与试剂1、实验材料 植物基因组DNA样品2、实验试剂ddH2O;TE缓冲液(pH8.0)。四、实验器材与仪器1、离心机、离心管(5ml)及离心管架;2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头;3、紫外分光光度计;4、石英比色皿(0.5cm光径)或1cm光径的微量石英比色皿(50ul、100ul)。五、实验操作方法和步骤 方法1:将提取的植物基因组DNA样品吸取20ul,加到新的5ml离心管中,再加一定量的ddH2O或TE缓冲液(pH8.0)稀释100倍,用0.5cm光径石英比色皿(约需1.6ml样品溶液)或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定230nm、260nm、280nm处的吸光度。计算植物基因组DNA样品溶液的DNA的含量以及DNA样品的纯度。方法2:直接取植物基因组DNA样品微量原液(12ul),用分光光度计进行自动测定出230nm、260nm、280nm处的吸光度值,计算植物基因组DNA样品溶液的DNA的含量以及DNA样品的纯度。用TE调0(空白):取植物基因组DNA样品原液12ul,进行自动测定230nm、260nm、280nm处的吸光度值:六、计算1、植物基因组DNA样品溶液的DNA的含量:DNA(g/l)=50OD260读数2*DNA样品稀释倍数/1000(*用0.5cm光径石英比色皿2,用1cm光径石英比色皿1。)2、植物基因组DNA样品溶液的DNA的纯度:OD260/OD280OD230/OD2603、样品纯度判断:OD260/OD2801.8,表示为纯的DNA;OD260/OD2801.9,表示有RNA污染;OD260/OD2801.6,表示有蛋白质、酚等污染。七、结果分析讨论下 次 实 验 课自主设计实验与实践 开题报告递交:自主设计实验与实践课题申请书 及“实验药品、器材和仪器需量申领表”
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