确定内部启动子的实验1原核生物rRNA基因原核与真核生物的rRNA基因在组织结构上的差异:重复频率：如E.coli，只重复了7次；细菌的16S rRNA 、23S rRNA 、5S rRNA基因组成一个转录单位，在染色体上的排列顺序是16S-23S-5S。2原核生物rRNA前体的加工3核糖体RNA的位置关系5 核糖体在组装过程中,某些蛋白质必须首先结合到rRNA上,其他蛋白才能组长上去即表现出先后层次。根据同rRNA结合的顺序,将核糖体蛋白分为两种:6初级结合蛋白(primary binding protein) 这些蛋白质直接同rRNA结合, 其中同16S rRNA结合的初级蛋白有14种: S3, S4, S17, S20, S6, S15, S8, S18, S9, S11, S12, S13, S7, S1。 同5S rRNA结合的有11种。次级结合蛋白(secondary binding protein) 这些蛋白质不直接同rRNA结合, 而是同初级结合蛋结合:S10, S16, S2, S6, S21, S14, S19。7核糖体蛋白空间定位8真核生物核糖体装配模型80S前体颗粒形成 45S rRNA+5S rRNA+蛋白质 45S rRNA 41S rRNA大小亚基前体形成: 大:32S rRNA和5S rRNA 小:20S的前体rRNA；小亚基成熟与运送: 20S rRNA18S rRNA大亚基成熟与运送 32S rRNA28S rRNA+5.8S rRNA?9核糖体的合成与装配106.3 核糖体的功能核糖体的RNA结合位点与mRNA结合的位点:SD序列蛋白质合成中各位点的协同性多聚核糖体(polysome)蛋白质合成的抑制剂蛋白质合成的基本过程蛋白质寿命?11核糖体的功能位点?12真核与原核mRNA的差异13SD(Shine-Delgarno) sequence14蛋白质合成中各位点的协同性15多聚核糖体?16嘌呤霉素对蛋白质合成的抑制作用17嘌呤霉素对蛋白质合成的抑制作用186.4 Ribozyme and Antisense RNA核酶(ribozyme)反义RNA(Antisense RNA)196.4.1 真核细胞中的小分子RNA(small RNA)大小:100300 bases由RNA聚合酶或RNA聚合酶所合成某些像mRNA一样可被加帽类别:scRNA snRNA20scRNA(small cytoplasmic RNA):snRNA(small nuclear RNA)： snRNPs(small nuclear ribonucleoproteins)颗粒；一个snRNA, 10个蛋白质;有些蛋白质是某一snRNP所特有，有些则是各种snRNP所共有； snRNPs分类: 由于snRNA富含脲嘧啶核苷，分类时把它分为U1、U2、等。21 6.4.2 Antisense RNA反义RNA分类I类 直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区;类: 与mRNA的SD序列的上游非编码区结合,从而抑制靶mRNA的翻译；III类: 核酶(ribozyme)226.4.3 RibozymeAn enzyme in which RNA rather than protein is responsible for catalytic activity.与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。23核酶的作用24核酶的发现几个基本概念间隔序列(space sequence)内含子(intron)外显子(exon)25卵清蛋白前体mRNA的加工26发现 1980s Thomas Cech等 研究四膜虫的26SrRNA前体加工 发现:26S rRNA前体可进行自剪切 (self- splicing)证明 26SrRNA基因克隆 无细胞系统中转录 研究26S rRNA的前体分子剪切27rRNA前体的自剪接2850S核糖体中23S rRNA核酶活性起因:肽酰转移酶(peptidyl transferase)发现者: Harry Noller等,1992年实验过程: 破坏50S亚基核糖体蛋白质 蛋白酶K、SDS、苯酚等 破坏rRNA 核酸酶处理50S亚基核糖体 抑制蛋白质合成 用抑制剂处理结论: 具有肽酰转移酶的活性分子是23SrRNA。296.4.3 核酶核酶的类型RNA和蛋白质复合物 核糖核酸酶 P (ribonuclease P),是一种核糖核蛋白, 含有一个tRNA分子(长为375个核苷)和一个分子量为20kDa的多肽。具有催化活性的小分子RNA、型内含子30 Splicing MechanismsNuclear splicingGroup I intron splicingGroup II intron splicing31RNA剪接的三种途径?32核剪接(nuclear splicing)即从pre-mRNA中切除内含子剪接发生在细胞核中加工成熟的mRNA被运送到细胞 质。33mRNA合成、加工与运输34真核生物mRNA的输出35Nuclear splicing Mechanisms GU-AG rule；Spliceosomes : Composed of proteins and RNAs. The RNA components of the spliceosome are five types of small nuclear RNAs (snRNAs) called U1, U2, U4, U5, and U6. Lariat-like structure 。 36核剪接37GU-AG rule38Group I intron splicing结构特点: 内含子转录后可以形成9个由碱基 配对形成的特定二级结构, 分别命 名为P1至P9, P1和P7是保守的。需要游离的鸟苷存在的细胞器:核、线粒体、叶绿体基因:前体rRNA、mRNA和tRNA39Group I intron splicing40Group II intron splicing结构特点: 内含子转录后可以形成6个发夹环GU-AG规则不需snRNA参与,不形成剪接体形成套索存在的细胞器:线粒体、叶绿体基因:前体mRNA41II组内含子的剪接42核酶与基因治疗榔头型核酶(hammerhead ribozyme)是植物病毒中的一种核酶催化时形成一种特殊的二级结构，类似榔头有一个双链螺旋的柄结构(柄II)核酶同靶RNA配对形成柄和柄切点在靶RNA的柄、柄配对区之间43榔头型核酶44RNA editing RNA editing refers to RNA processing events (other than splicing) that alter the protein-coding sequences of some mRNAs. This unexpected form of RNA processing was first discovered in mitochondrial mRNAs of trypanosomes(锥虫), in which U residues are added and deleted at multiple sites along the molecule. More recently, editing has also been described in mitochondrial mRNAs of other organisms, chloroplast mRNAs of higher plants, and nuclear mRNAs of some mammalian genes.45Editing in mammalian nuclear mRNAs, as well as in mitochondrial and chloroplast RNAs of higher plants, involves single base changes as a result of base modification reactions;RNA editing reactions include the deamination of cytosine to uridine and of adenosine to inosine(次黄苷);Apo-B48(2152 amino acids) is synthesized in the intestine as a result of translation of an edited mRNA in which a C has been changed to a U by deamination. 46Apolipoprotein B RNA编辑47机制:引导RNA(guide RNA, gRNAs)gRNAs的结构:编辑体(editosome)U的供体48指导RNA的作用49