第5章 微生物的遗传变异与菌种选育5.1微生物遗传变异的物质基础5.2微生物的基因突变5.3微生物的基因重组5.4微生物的菌种选育5.5微生物菌种的保藏和复壮l微生物是现代遗传学、分子生物学和其它许多重要的生物学基础研究中最热衷选用的模式生物。研究微生物遗传学的意义l为什么进化的速度以及复杂性变得越来越快？l根据化石记录显示，单细胞生物于35亿年前首次出现在地球上，但是之后它们用了大约25亿年进化成多细胞生物，剩下的10亿年却发展成了植物、哺乳动物、昆虫、鸟类等各种各样的地球物种。lRice大学科学家的研究结果可望解决这一问题，他们认为生物进化速度的加快是因为细菌和病毒不断在不同物种之间传递DNA，如果没有这种作用，只依靠基因突变和两性选择作用是不会达到如此快速度的。l对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学现代分子生物学和生物工程学生物工程学的发展，而且为育育种工作种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。遗传与变异的概念l遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。l遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；-是一种内在可能性或潜力。遗传型+环境条件表型l表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;l是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。代谢发育变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。 特点: a.在群体中出现几率极低，（一般为10-610-10） b.形状变化的幅度大； c. 变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。遗传与变异的概念5.1微生物遗传变异的物质基础v种质连续理论：18831889年间Weissmann(魏斯曼)提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。v基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。 染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。vDNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验v5.1.1肺炎双球菌转化实验（transformation）：1928年,英国医学微生物学家格里菲斯(fgriffith)发现肺炎球菌的转化现象，v研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）vS型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜vR型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜图5-1 肺炎双球菌动物转化试验 1928年，格里菲斯格里菲斯( (fgriffithfgriffith) )进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌 小鼠存活对小鼠注射活S菌小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌 小鼠死亡（2）细菌培养实验热死S菌不生长活R 菌长出R菌热死S菌+活R 菌长出大量R菌和10-6S菌（3）S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌以上实验说明：加热杀死的以上实验说明：加热杀死的S S型细菌细胞内可能存在型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入一种转化物质，它能通过某种方式进入R R型细胞并型细胞并使使R R型细胞获得稳定的遗传性状型细胞获得稳定的遗传性状v加S菌DNAv加S菌DNA及DNA酶以外的酶v加S菌的DNA和DNA酶v加S菌的RNAv加S菌的蛋白质v加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年O.T.Avery(埃弗里)、C.M.MacLeod(麦克劳德)和M。McCarty(麦卡蒂)从热死S型肺炎球菌 S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将肺炎球菌 S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。5.1.1.2噬菌体的感染实验lA.D.Hershey(赫西)和M.Chase(蔡斯)，1952年（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。5.1.1.3烟草花叶病毒的拆开与重组实验v为了证明核酸是遗传物质，弗伦克尔-康拉特(H.Fraenkel-Conrat)（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。v将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。v选用烟草花叶病毒(TMV)和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：（1）RNA（TMV） 蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV） 蛋白质（TMV）v用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。v上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。5.1.1.3烟草花叶病毒的拆开与重组实验图5-4 TMV重建实验示意图 DNA的组成元素脱氧核苷酸规则的双螺旋结构5.1.2DNA结构与复制DNA的基本单位DNA的多样性DNA的特异性碱基对的排列顺序千变万化特定的碱基排列顺序DNA的空间结构C、H、O、N、P5.1.2.1DNA的结构脱氧核苷酸的结构与种类脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）脱氧核苷酸种类腺嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸DNA的空间结构-规则的双螺旋结构19531953年由沃森和克里克提出年由沃森和克里克提出1.DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构2.脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧。3.两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对。DNA就是脱氧核糖核酸（长链）腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G）胸腺嘧啶（T） 胞嘧啶（C）ATCGAAATTTTTTAAAGGGGGCCCCCGC基因测序就是读出 A-C-G-T-G-G-A-C-G.每条多核苷酸链上均有四种碱基的结构利用碱基互补配对规律的计算5.1.2.1 DNA的结构规律一：DNA双链中的两条互补链的碱基相等，任意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的50%。即：A+GT+CA+CT+G50%，（A+G）/(T+C)(A+C)/(G+T)(T+C)/(A+G)1。规律二：在DNA双链中的一条单链的A+GT+C的值与另一条互补链的T+CA+G的值互为倒数关系。规律三：DNA双链中，一条单链的A+TG+C的值与另一条互补链的A+TG+C的值是相等的，也与整个DNA分子中的A+TG+C的值相等 。复制的时期细胞分裂间期复制的场所细胞核复制的模板DNA母链原材料脱氧核苷酸基本条件 模板、原料、酶、ATP复制过程解旋、碱基配对、聚合复制特点边解旋边复制（过程）半保留复制（结果）遵循原则碱基互补配对原则5.1.2.2 DNA的复制5.1.2.3RNAl核糖核酸（缩写为RNA)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名,简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。RNA一般是单链线形分子;也有双链的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA；1983年还发现了有支链的RNA分子。5.1.2.3RNAlRNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤，G鸟嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成为RNA的特征碱基。5.1.2.3RNAl与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。5.1.2.3RNAl在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，l即tRNA（转运RNA）,lrRNA（核糖体RNA）,lmRNA（信使RNA）。lmRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。核糖核酸核糖核酸5.1.3 5.1.3 遗传物质存在方式 （1）细胞水平 从细胞水平看，无论是原核微生物还是真核微生物，遗传物质全部或大部分DNA都集中在细胞核或核区中。不同的微生物细胞或是同种微生物的不同类型细胞中，细胞核的数目是不同的。在细菌和酵母菌中，尽管在高速生长阶段出现多核现象，但最终一个细胞只有一个核，部分霉菌和放线菌的菌丝细胞往往是多核的。 在真核微生物的细胞核中，DNA与蛋白质结合在一起形成染色体，外包裹一层核膜，从而构成的在光学显微镜下清晰可见的完整细胞核。如霉菌、酵母菌、藻类和原生动物等。而原核微生物的细胞核无核膜，DNA在细胞内以核质体的形式存在。如细菌、放线菌和蓝细菌等，也有人把没有细胞结构的病毒称为原核微生物。 5.1.3 5.1.3 遗传物质存在方式 真核微生物的每个细胞核中的染色体数目较多，且其数目随着种类的不同而不同；而原核微生物中，核区只有一个由裸露的DNA构成的，光学显微镜下无法看到的、一般呈环状的染色体。除此之外，染色体的套数也有不同。如果在一个细胞中只有一套相同功能的染色本，它就是一个单倍体。在自然界中发现的微生物，多数都是单倍体，高等动植物的性细胞都是单倍体；反之，包含着两套相同功能染色体的细胞，就称双倍体。如高等动植物的体细胞，少数微生物（如啤酒酵母）的营养细胞及由两个单倍体的性细胞接合或体细胞结合后所形成的合子等都是双倍体。 5.1.3 5.1.3 遗传物质存在方式 （2）分子在细胞核中，微生物的遗传物质是核酸，除部分病毒（大多数为植物病毒）的遗传物质是RNA外，大多数微生物的遗传物质是DNA，即在DNA大分子上存在着决定某些遗传性状的特定区段基因，它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的核酸区段。一个基因是由若干个核苷酸碱基组成的三联密码子所构成的。 生物体内的无数蛋白质是生物体各种生理功能的执行者，但是蛋白质并不能自我复制，它是由DNA分子结构上的遗传信息来合成的。 5.1.3 5.1.3 遗传物质存在方式 其过程是首先通过转录作用将DNA上的遗传信息转录到mRNA上去，形成一条与DNA碱基互补的mRNA链，然后再通过转译作用由mRNA上的三联密码顺序去决定蛋白质上的氨基酸的排列顺序。这一过程就是转录与翻译。DNA上