UPLC-MSMS法同时测定香青兰中6个活性成分的含量香青兰是唇形科青兰属一年生草本植物，又名青兰、摩眼子、山薄荷、毕日阳古、白赖洋古蒙、巴迪然吉布亚维等，为蒙古族和维吾尔族习用药材，主要分布于我国东北三省、内蒙古、甘肃、山西、青海、新疆等1。无误蒙药鉴中记载：“主治胃肝热，胃出血，食物中毒，赫如虎，巴木病等2”；维吾尔药志记载其具有安神补脑，镇咳止喘，强心利尿等功效，用于治疗冠心病及高血压等疾病3；卫生部药品标准（维药分册）收载的成方制剂中，组方含香青兰的制剂有6种，多用于心悸、心痛方面疾病的治疗；其单方制剂“益心巴迪然吉布亚颗粒”治疗冠心病具有良好的疗效4,5。前人对香青兰中的活性成分也做了一系列研究：其地上全草主要含有挥发油、萜类化合物、黄酮类化合物、氨基酸及多种微量元素等6,7,8,9。本课题组在前期的基础研究中，从香青兰地上全草分离得到2个萜类化合物：熊果酸、齐墩果酸；3个黄酮类化合物：异鼠李素、木犀草素、山柰酚；1个苯丙素：迷迭香酸。现代药理学实验研究表明，熊果酸与齐墩果酸具有血管保护作用和改善血管功能，对正常的和多种高血压动物有显著的降压作用10；木犀草素、山柰酚、迷迭香酸具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多方面药理活性11,12,13,14；异鼠李素具有祛痰止咳，消食化滞，活血散瘀等功效15。可见这些成分的药理活性与香青兰清热止咳，改善与调节血液流变性，抗氧化，对心肌缺血具有保护作用等方面的功效相符合16，推测这些成分应该是香青兰发挥临床疗效的物质基础，因此，开展这些活性成分的定量研究，对于提高香青兰质量标准和保障其药物稳定性具有重要的意义。近年来，已有关于香青兰中活性成分含量测定的研究报道，但其测定成分较少，且基本上都是采用HPLC-UV方法测定17,18,19，这些方法测定时间较长，且检测灵敏度较差。本研究采用灵敏度、选择性和精确度更高的UPLC-MS/MS技术，通过正、负离子切换扫描，MRM采集模式，建立了测定香青兰中齐墩果酸、熊果酸、迷迭香酸、木犀草素、异鼠李素、山柰酚共6个主要活性成分含量的方法，可更加快速、高效和全面地对香青兰进行质量分析和控制。1、仪器与试药ThermoU3000超高效液相色谱仪（Thermo公司）；TSQULTRAEMR三重四极杆质谱（Thermo公司）；WatersTMUPLCBEHC18色谱柱（2.1mm100mm,1.7m)(Waters公司）；BP211D型十万分之一天平（Sartorius公司）；AB104型万分之一电子天平（METTLERTOLEDO公司）；BX7200HP超声清洗器（上海新苗医疗器械制造有限公司）。对照品熊果酸（C1，批号110742-201823，含量99.9%）、齐墩果酸（C2，批号110709-201808，含量91.1%）、迷迭香酸（C3，批号111871-201706，含量90.5%）、木犀草素（C4，批号111520-201605，含量99.6%）、异鼠李素（C5，批号110860-201611，含量99.8%）、山柰酚（C6，批号110681-201611，含量98.0%）购自中国食品药品检定研究院；色谱级甲醇、乙腈（Merck公司），MS分析用甲酸（FisherScientific公司），Milli-Q超纯水（Millipore公司），其余试剂均为分析纯。于2018年7月至8月间收集不同产地香青兰样品4批（新疆维吾尔自治区吉木萨尔药材种植基地，批号20180713；新疆维吾尔自治区沙依巴克区墨玉县，批号20180724；内蒙古通辽市扎鲁特旗，批号20180804；内蒙古锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗，批号20180822）。所有样品经内蒙古医科大学药学院药用植物学教研室乔俊缠教授鉴定为唇形科植物香青兰（DracocephalummoldavicaL.）正品。2、方法与结果2.1色谱条件WatersTMUPLCBEHC18色谱柱（2.1mm100mm,1.7m），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（02min,95%A;28min,95%A5%A;810min,5%A;1010.1min,5%A95%A;10.112min,95%A），流速0.3mLmin-1，柱温30，进样量5L。2.2质谱条件电离模式ESI+（山柰酚），ESI-（齐墩果酸、熊果酸、木犀草素、迷迭香酸、异鼠李素）；喷雾电压：（+）3.2kV、（-）3kV；雾化温度：200；吹扫气压力：275.8kPa；辅气压力：68.95kPa；毛细管温度：350。其他优化的质谱条件见表1。表1香青兰中6个活性成分质谱优化条件在该色谱和质谱条件下，上述6个活性成分均能得到有效分离，峰形对称，灵敏度良好，见图1。2.3供试品溶液的制备取香青兰药材（批号20180713）粉碎，过60目筛，得香青兰药材粉末。取香青兰粉末0.2g（精确至0.0001g），加入50%甲醇25mL（精确至0.01mL），密塞，称量，超声处理（功率250W；频率50kHz)30min，冷却至室温，再称量，用50%甲醇补足减失的量，摇匀，滤过（0.22m滤膜），取续滤液，即得。2.4对照品溶液的制备取干燥至恒重的对照品熊果酸、齐墩果酸、迷迭香酸、木犀草素、异鼠李素、山柰酚适量，精密称定，分别用甲醇制备成质量浓度约为10.3、11.2、9.2、10.1、9.5、9.3mgL-1的单一对照品储备液，用于优化质谱条件。其他梯度浓度的对照品溶液由50%甲醇稀释储备液获得。2.5方法学考察2.5.1线性关系考察取“2.4”项下的各对照品储备液，用50%甲醇稀释配制系列梯度浓度的混合对照品溶液（每种对照品各包含10个浓度点），测定其峰面积。以峰面积（Y）对待测物浓度（X）做线性回归，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，并以S/N=3计算检测下限（LOD），以S/N=10计算定量下限（LOQ），结果见表2。2.5.2精密度试验取线性关系考察项下低、中、高3种浓度的（C1:0.2062、2.0370、10.3123mgL-1;C2:0.2242、2.2153、11.2150mgL-1;C3:0.1838、1.8151、9.1890mgL-1;C4:0.4055、2.0025、10.1378mgL-1;C5:0.5691、1.8777、9.5060mgL-1;C6:0.5596、1.8515、9.3733mgL-1）混合对照品溶液，1d内连续进样6次，及每日1次连续测定6d，根据标准曲线计算浓度，并记录其保留时间，其日内精密度RSD范围分别为1.4%2.0%、00.40%；日间精密度RSD范围分别为1.6%3.2%、0.30%0.50%。表明仪器精密度良好。2.5.3稳定性考察取香青兰药材粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、6、10、18和24h依法测定，根据标准曲线计算浓度。其RSD范围均在0.94%2.0%。表明供试品溶液在24h内稳定。2.5.4回收率试验精密称取6份已知含量的香青兰药材粉末（批号20180713），约0.1g，等量精密加入混合对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试溶液，并进行峰面积的测定，计算6个活性成分的加样回收率，结果见表3。图1熊果酸（A）、齐墩果酸（B）、迷迭香酸（C）、木犀草素（D）、异鼠李素（E）、山柰酚（F）的二级色谱、质谱图及样品中6个活性成分TIC图（G)表26个活性成分的回归方程、线性范围、检测下限及定量下限表36个活性成分在样品中的加样回收率（n=6)3、样品含量测定按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定峰面积，根据标准曲线计算含量，结果见表4。不同批次香青兰中以苯丙素类化合物迷迭香酸的含量最高，黄酮类成分山萘酚的含量最低。6个主要成分的总含量以产自新疆沙依巴克区墨玉县的样品最高，达到10.70mgg-1；产自内蒙古锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗的样品总含量最低，仅为8.35mgg-1。表中还可见，产于新疆的香青兰药材质量要优于产于内蒙古境内的香青兰药材。表4不同批次香青兰样品中6个活性成分的含量（n=5)4、提取方法、色谱及质谱条件优化实验中首先考察了连续回流提取法和超声提取法，发现超声提取完全可以满足实验需要，且操作简单，方便快捷；又进一步考察了不同提取溶剂，50%甲醇较30%甲醇、80%甲醇可获得更高的提取效率；提取溶剂用量考察时发现，被提取物与溶剂比为1125(gmL）的时候，提取效率最高。同时还考察了提取时间（15、30、60min）对提取效率的影响：提取30min时提取效率达到最高，随着提取时间的延长，提取效率无明显差异。因此本实验的最终优化条件为香青兰药材粉末0.2g，加50%甲醇25mL，超声提取30min。之后又对常用的流动相体系：甲醇-水、乙睛-水、甲醇-乙酸铵水溶液（5mmolL-1）、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙睛-乙酸铵水溶液（5mmolL-1）、乙睛-0.1%甲酸水溶液进行了考察20。实验结果显示，乙腈体系的灵敏度及峰形要优于甲醇体系，流动相中不使用添加剂时，色谱峰峰形较差，拖尾现象比较严重，且响应不高，灵敏度差，可能是离子化程度较低；加入5mmolL-1乙酸铵时，峰形有所改善，但色谱峰灵敏度仍不高，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液做流动相时，色谱峰峰形对称，灵敏度提高，因此，色谱条件最终确定为乙腈-0.1%甲酸水系统。待分析化合物中，熊果酸、齐墩果酸为三萜酸，迷迭香酸为多酚酸，木犀草素、异鼠李素及山柰酚均为具多个酚羟基的黄酮类化合物，易于在负离子模式下失去1个质子，生成稳定的M-H-准分子离子峰，因此采用负离子MRM模式扫描。在此条件下，熊果酸、齐墩果酸、迷迭香酸、木犀草素、异鼠李素很容易产生稳定的M-H-分子离子，响应良好，灵敏度高。最终确定熊果酸母离子的m/z为455.51，齐墩果酸母离子的m/z为455.32，迷迭香酸母离子的m/z为358.93，木犀草素母离子的m/z为285.03，异鼠李素母离子的m/z为315.12。但此条件下山柰酚的灵敏度不高，将山柰酚采用正离子模式扫描，其m/z153的子离子为其母离子C环1,4位RDA裂解合A环的碎片峰1,4A+21，在正离子模式下其响应及灵敏度均明显提高。采用外接蠕动泵直接进样的方法优化各化合物的质量调谐参数（masstune），并以不同的碰撞能量打碎待测物的准分子离子，以子离子响应最强时的参数来确定待测离子对的最优质谱条件。5、结论本文建立了UPLC-MS/MS同时测定香青兰药材中萜类、苯丙素类及黄酮类化合物含量的方法。实验结果显示，该方法简便、快捷，准确度好，灵敏度高，为香青兰的质量控制、药理活性和药代动力学等相关研究提供新的参考依据，并且对香青兰的有效利用，推动民族医药事业的快速发展都有十分重要的意义。参考文献：1阿布卡德,田友清,尚靖.香青兰研究进展J.北方药学,2011,8(2):55.2占布拉道尔吉.无误蒙药鉴M.呼和浩特:内蒙古人民出版社,1998:150.3刘勇民.维吾尔药志(上册)M.乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1999:405.4萨迪克司依提.维吾尔药益心巴迪然吉布亚颗粒治疗心血管疾病的疗效分析J.中西医结合心血管病电子杂志,2017,5(19):140.5于宁,陈文,邢建国,等.HPLC法测定益心巴迪然吉布亚颗粒中4种化学成分的含量J.药物分析杂志,2015,35(4):670.6王亚俊.青兰属植物香青兰化学成分及活性研究D.济南:山东大学,2010.7吴明如,王丹,赵剑.香青兰的化