浅析新型Cry1Bd蛋白和原核表达方法苏云金芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，能够在不同的生长时期产生不同种类的杀虫蛋白。比如，对数生长中期可以分泌外毒素，其被称为营养期杀虫蛋白1；芽孢形成的时候会产生杀虫晶体蛋白2。其中，研究最早，最广泛的是杀虫晶体蛋白，其可分为Cry(Crystalprotein，晶体毒素）和Cyt(Cytoliticprotein，细胞裂解素）两大类。Bt杀虫蛋白的广谱性，使其成为农业研究和生产中关注的热点。从第一个cry基因cry1Aa13被克隆之后，Cry蛋白被相继发现4。为便于对众多Cry蛋白进行归类和研究，人们建立了Cry蛋白分类和命名的规则3。Cry蛋白的表达模式、基本空间结构和杀虫机制等均已被深入研究5,6,7,8,9。目前，多种Cry蛋白已被成功用于转基因抗虫作物，例如Cry1A蛋白在棉花中表达，可有效地减少棉铃虫的侵害10;Cry1Ac和Cry1C蛋白在花椰菜中同时表达，可使花椰菜中小菜蛾的抗性推迟11；在棉花中表达Cry2Ab蛋白，能够使棉铃虫停止摄食，从而饥饿至死12;Cry1Ia蛋白能够毒害鳞翅目和鞘翅目的昆虫13；同时，Cry1Ia也是少有的能够在大肠杆菌中可溶性表达的Cry蛋白14。因此，不断筛选新的Cry蛋白能够为农业生产提供更多的抗虫资源。Cry1B是Cry1类蛋白的一个分支，其分子质量大小约为140ku，与传统的Cry蛋白一样都具有3个经典结构域，且这3个结构域与杀虫活性密切相关5,6,7,8,9。通过结构域的交换获得新的杀虫谱或改变杀虫活性，是Cry蛋白常见的改造方式15。目前，已知的Cry1B蛋白有10个亚类，分别是Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Bd、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi和Cry1Bj4。本研究以山西农业大学杂粮分子育种团队前期筛选并克隆的一个新的cry1Bd基因（命名为new-cry1Bd）为研究对象，首先分析了该基因编码蛋白new-Cry1Bd与Cry1B系列蛋白的亲缘关系，然后将cry1Bd基因克隆至pHT304质粒，并检测其蛋白表达；另外，将new-Cry1Bd蛋白N端部分进行独立表达，检测其表达稳定性，旨在为后续研究和利用该杀虫蛋白奠定基础。1、材料和方法1.1材料供试菌株为大肠杆菌（Escherichiacoli)TG1菌株和苏云金芽孢杆菌BMB171菌株。试剂为TaKaRaprimeSTARRHSDNAPolymerasewithGCBuffer（货号R044A）试剂盒；南京诺唯赞生物科技有限公司重组试剂盒ClonExpressRIIOneStepCloningKit（货号c112-02）；中科瑞泰的1kbPlusDNAladder（货号RTM418);AxyGEN质粒小提试剂盒（货号AP-MN-P-250G）和DNA回收试剂盒（货号AP-GX-50G);Thermo的限制性内切酶BamHI、SacI、KpnI、EcoRI和蛋白质标准分子量PageRulerPrestainedProteinLadder。引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.2方法1.2.1氨基酸多序列比对构建进化树从NCBI网站上下载Cry1B蛋白家族中12个蛋白（Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi和Cry1Bj以及3种Cry1Bd蛋白）的氨基酸序列，使用MegaX将new-Cry1Bd蛋白序列与这12个蛋白的氨基酸序列进行聚类分析（Neighborjoining法）16,17。1.2.2表达载体的构建首先，用BamHI和SacI双酶切p304-2Ab-1I质粒18，用DNA回收试剂盒回收相应载体片段。以新分离鉴定的new-cry1Bd基因作模板，用引物1Ball-CDS-R和1B-CDS-F进行PCR扩增，获得相应的目的基因；然后通过重组克隆将目的基因克隆至上述线性化载体中，并转化大肠杆菌TG1菌株；通过酶切鉴定，将正确的质粒命名为p304-new-cry1Bd，含有该质粒的大肠杆菌命名为T304-new-cry1Bd；以p304-new-cry1Bd为模板，用引物1B-CDS-F和1-half-R-new扩增Cry1Bd蛋白N端编码序列，并用相同的方法克隆至上述线性化的p304-2Ab-1I载体中，将该质粒命名为p304-new-cry1Bdhalf，含有该质粒的大肠杆菌命名为T304-new-cry1Bdhalf。1.2.32种蛋白的表达与可溶性分析将成功构建的2个表达载体和pHT304质粒，用电击法分别转入苏云金芽孢杆菌BMB171感受态细胞19,20；用涂布平板法平铺到含有25g/mL红霉素的固体LB培养基上，28.5过夜培养；分别将这3个菌株的单克隆接种于3mL液体LB培养基（含有25g/mL的红霉素），28.5过夜培养72h。每个试管各取2mL菌液，12000r/min离心10min，分离上清和沉淀。向沉淀中加入800LNa2CO3溶液（50mmol/LNa2CO3,10mmol/LDTT,pH值为10.5），放入37恒温摇床，200r/min振荡1h；然后12000r/min4离心20min，分离上清和沉淀。所有上清用3ku的超滤管超滤至160L。沉淀用160LPBS(137mmol/L的NaCl、2.7mmol/L的KCl、10mmol/L的Na2HPO4、2mmol/L的KH2PO4,pH值7.4）重悬。所有样品中，加40L的5Proteinloadingbuffer，沸煮10min；然后，12000r/min离心5min，上样，进行SDS-PAGE电泳，并分析蛋白表达及可溶性。2、结果与分析2.1new-Cry1Bd蛋白亲缘关系分析将new-Cry1Bd蛋白与12种Cry1B蛋白进行亲缘关系分析，结果发现,new-Cry1Bd蛋白与Cry1Bd蛋白更接近，将该蛋白与Cry1Bd1进行氨基酸序列比对，结果发现有3处差异，即Cry1Bd1蛋白第572位为丝氨酸（S），而new-Cry1Bd中变成亮氨酸（L）；第1147位氨基酸由谷氨酸（E）变成天冬氨酸（D）；第1227位氨基酸由亮氨酸（L）变成苯丙氨酸（F）。其中，L572位于Cry1B蛋白的结构域III(DomainIII），另外2个差异位点位于其C端尾部，推测对其杀虫活性影响不大。将new-Cry1Bd蛋白与12种Cry1B蛋白进行亲缘关系分析，结果发现,new-Cry1Bd蛋白与Cry1Bd蛋白更接近，将该蛋白与Cry1Bd1进行氨基酸序列比对，结果发现有3处差异，即Cry1Bd1蛋白第572位为丝氨酸（S），而new-Cry1Bd中变成亮氨酸（L）；第1147位氨基酸由谷氨酸（E）变成天冬氨酸（D）；第1227位氨基酸由亮氨酸（L）变成苯丙氨酸（F）。其中，L572位于Cry1B蛋白的结构域III(DomainIII），另外2个差异位点位于其C端尾部，推测对其杀虫活性影响不大。2.32个蛋白的表达和可溶性分析对new-Cry1Bd和new-Cry1Bdhalf这2种蛋白的表达产物进行可溶性试验，结果显示，2种蛋白的表达产物均能部分溶解于碱性Na2CO3溶液，其中，完整的new-Cry1Bd溶解比例高于new-Cry1Bdhalf。3、结论与讨论前期，我们筛选了8种新型cry1B基因21。本研究又获得一种新的Cry1B蛋白（new-Cry1Bd），通过将其与其他Cry1B家族代表比较亲缘关系，结果发现，该蛋白与Cry1Bd蛋白最为相似。将该蛋白氨基酸序列与3种Cry1Bd分支进行深入比对，结果发现，相比Cry1Bd1蛋白，new-Cry1Bd蛋白仅有3个差异氨基酸。其中，1个位于N端结构域III区域（L572），另外2个位于C端尾部（D1147和F1227）。其中，位于N端结构域III的差异氨基酸L572，在其他已知的3种Cry1Bd蛋白中相对保守，均为丝氨酸，但这2种氨基酸性质差异较大，因此，可能对该蛋白的活性或稳定性产生一定的影响；位于C端的2个差异位点在3种已知的Cry1Bd蛋白中也较为保守，但是由于C端不参与Cry蛋白杀虫活性4,5,6,7,8，因此，推测这2处的氨基酸差异与new-Cry1Bd杀虫活性无关。为了进一步研究new-Cry1Bd蛋白的杀虫活性和应用潜力，本研究构建了该蛋白及其N端编码序列（Cry1Bdhalf）的表达载体，并将这2种载体分别转化Bt菌株进行目的蛋白的表达，结果显示，不论完整的new-Cry1Bd还是其N端多肽，均能够在Bt细胞中表达，但这2种表达产物的可溶性差异较大，约1/2左右的new-Cry1Bd蛋白可以溶于碱性Na2CO3溶液，而仅有很少比例的new-Cry1Bdhalf可以溶解。结果说明，Cry1Bd蛋白的C端对其表达产物的结构具有较大的影响，这与其他Cry蛋白一致3,5。综上所述，本研究报道了一种新型的Cry1Bd蛋白，该蛋白与Cry1Bd1的亲缘关系最近，仅有3个氨基酸差异。该蛋白的发现为Cry1Bd分支增添了新成员，更为重要的是，new-Cry1Bd在其执行杀虫活性的N端部分仅1个氨基酸差异。因此，该蛋白也可以直接作为1个点突变体研究Cry1Bd系列蛋白的杀虫机制。将含有p304-new-cry1Bd或p304-new-cry1B-dhalf的Bt菌株培养72h后，检测其蛋白表达情况，同时对其表达产物的可溶性进行分析，结果显示（图4),new-Cry1Bd和new-Cry1Bdhalf蛋白均能表达，且其大小均与预期一致，分别为139.7、80.8ku。参考文献：1翟元娜,张杰,高继国.苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A研究进展J.东北农业大学学报,2009,40(8):123-127.5彭琦,周子珊,张杰.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白研究进展J.中国生物防治学报,2015,31(5):712-722.10张安红,罗晓丽,肖娟丽,等.Bacillusthuringiensis营养期杀虫蛋白Vip3与其转基因植物研究进展J.山西农业科学,2012,40(5):550-552.14郭小琴,钱红梅,郭星,等.Cry1Ia蛋白的表达与纯化J.山西农业科学,2019,47(5):748-750,769.15高建华,王思宇,黄婷婷,等.Cry1Ia和Cry2Ab杂交分子的构建和表达J.山西农业科学,2015,43(5):521-523,531.18郭小琴,钱红梅,郭俊佩,等.Cry1Ia和Cry2Ab融合蛋白的表达J.山西农业大学学报(自然科学版),2019,39(3):101-105.20李林,杨超,刘子铎,等.苏云金芽孢杆菌无晶体突变株的逐级升温筛选及其转化性能J.微生物学报,2000,40(1):85-90.21米怡,罗舒予,高建华,等.新Cry1B蛋白基因的筛选与鉴定J.山西农业大学学报(自然科学版),2016,36(12):875-878.钱红梅,郭俊佩,刘小琼,欧阳春平,高建华.一种新型Cry1Bd蛋白及其原核表达J.山西农业科学,2020,48(05):683-686+695.基金:国家自然科学基金项目(31601690).