Word文档工业微生物产生菌的分离筛选（三）经富集培育以后的样品,目的微生物得到增殖,占了优势,其他种类的微生物在数量上相对削减,但并未死亡.富集后的培育液中仍旧有多种微生物混杂在一起,即使占了优势的一类微生物中,也并非纯种.例犹如样一群以油脂为碳源的脂肪酶产生菌,有的是细菌,有的是霉菌,有的是芽孢杆菌,有的不产芽孢,有的生产力量强,有的生产力量弱等等.因此,经过富集培育后的样品,也需要进一步通过分别纯化,把最需要的菌株直接从样品中分别出来. 一、好气微生物的分别 分别的方法许多,大体可分为两类：一类较为粗放,只能达到菌落纯,如稀释涂布法,划线分别法,组织分别法等.前两种方法由于操作简便有效,工业生产中应用较多.组织分别法则通常是从有病或特别组织中分别菌株.另一类是较细的单细胞或单孢子分别方法,可达到菌株纯或细胞纯的水平.这类方法需采纳特地的仪器设备,简单的如显微操作装置,简洁的可利用培育皿或凹玻片作分别小室进行分别.下面对这几种分别纯化方法分别加以介绍. (一)稀释涂布法 把土壤样品以十倍的级差,用无菌水进行稀释,取肯定量的某一稀释度的悬浮液,涂抹于分别培育基的平板上,经过培育,长出单个菌落,挑取需要的菌落移到斜面培育基上培育.土壤样品的稀释程度,要看样品中的含菌数多少,一般有机质含量高的菜园土等,样品中含菌量大,稀释倍数高些,反之稀释倍数低些.采纳该方法,在平板培育基上得到单菌落的机会较大,特殊适合于分别易扩散的微生物. (二)划线分别法 用接种环取部分样品或菌体,在事先已预备好的培育基平板上划线,当单个菌落长出后,将菌落移入斜面培育基上,培育后备用.该分别方法操作简便、快捷,效果较好. 在样品含菌量较少或某种目的微生物不多的状况下,微生物的纯种分别方法可以简化如下：第一种方法,取一支盛有35ml无菌水的粗试管或小三角瓶,取混匀的样品少许(0.5g左右)放入其中,充分振荡分散,用灭菌滴管取一滴土壤悬液于琼脂平板上涂抹培育,或者用接种环接一环于平板上划线培育.这种方法不需要菌落计数,比以上常规稀释法简便.其次种方法,取风干粉末状的土样少许(几十毫克)直接洒在选择性分别培育基平板上或混入培育基中制成平板,置适温培育肯定时间,长出菌落.例如分别小单孢菌就可采纳该方法,从河泥中取样,风干研碎,取样品粉末2050mg直接加到天门冬酰胺培育基中,混合匀称制成平板,培育后长出鱼卵状菌落.这种方法有时分别不够充分,可用划线法进一步纯化. (三)利用平皿的生化反应进行分别 这是一种利用特别的分别培育基对大量混杂微生物进行初步分别的方法.分别培育基是依据目的微生物特别的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的.通过观看微生物在选择性培育基上生长状况或生化反应进行分别,可显著提高菌株分别纯化的效率. 1. 透亮圈法 在平板培育基中加入溶解性较差的底物,使培育基混浊.能分解底物的微生物便会在菌落四周产生透亮圈,圈的大小初步反应当菌株利用底物的力量.该法在分别水解酶产生菌时采纳较多,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培育基平板上形成肉眼可见的透亮圈.在分别淀粉酶产生菌时,培育基以淀粉为惟一碳源,待样品涂布到平板上,经过培育形成单个菌落后,再用碘液浸涂,依据菌落四周是否消失透亮的水解圈来区分产酶菌株.如要分别该酸水解酶产生菌,可用双层平板法,首先在一般平板培育基上把悬浮液涂抹培育,等长出菌落后掩盖一层养分琼脂,内含3%酵母RNA,0.7%琼脂及 0.1mol/LEDTA,pH7.0,于42左右培育24h,四周产生透亮圈的菌落,即为核酸分解酶产生菌. 在分别某种产生有机酸的菌株时,也通常采纳透亮圈法进行初筛.在选择性培育基中加入碳酸钙,使平板成混状,将样品悬浮液涂抹到平板上进行培育,由于产生菌能够把菌落四周的碳酸钙水解,形成清楚的透亮圈,可以轻易地鉴别出来.分别乳酸产生菌时,由于乳酸是一种较强的有机酸,因此,在培育基中加入的碳酸钙不仅有鉴别作用,还有酸中和作用. 2. 变色圈法 对于一些不易产生透亮圈产物的产生菌,可在底物平板中加入指示剂或显色剂,使所需微生物能被快速鉴别出来.如筛选果胶酶产生菌时,用含0.2%果胶为惟一碳源的培育基平板,对含微生物样品进行分别,待菌落长成后,加入0.2%刚果红溶液染色4h,具有分解果胶力量的菌落四周便会消失绛红色水解圈.在分别谷氨酸产生菌时,可在培育基中加入溴百里酚蓝,它是一种酸碱指示剂,变色范围在pH6.27.6,当pH在6.2以下时为黄色,pH7.6以上为蓝色.若平板上消失产酸菌,其菌落四周会变成黄色,可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌. 在进行解脂微生物的分别时,虽然有许多精确的测定方法,如酸碱滴定法、电位滴定法、浊度滴定法、甘油滴定法及色谱分析法等,但由于步骤繁琐,不适于大规模筛选测定.为提高分别筛选效率,多采纳固体平板的变色圈法,如以吐温为底物,尼罗蓝(Nile blue)作为指示剂,依据变色圈大小来推断脂肪酶活性的凹凸；也可用甘油三丁酸酯为底物,罗丹明B为指示剂,以荧光圈的大小来测定.最常使用的方法是把恶秦染料中的维多利亚蓝和脂类底物混合,制成维多利亚蓝乳脂琼脂培育基平板,起始培育基调为中性,当土壤样品的悬浊液分别在平板上,具有脂解力量的菌落产生的脂肪酶水解油脂底物,使pH值由中性下降到微酸性或酸性,阳性解脂反应能显示粉红到蓝色的变化.如培育基起始pH为碱性,则阳性解脂反应从咖啡色到蓝绿色,能使脂类底物和解脂后的脂肪酸区分开来.后来又由Fryer等讨论出一种改良的双层法,先在平皿内倒一层养分琼脂,把一张棉纸圆片在被维多利亚蓝染了色的乳脂中浸湿,铺在已凝固的琼脂表面,然后掩盖一薄层含样品的养分琼脂,保温培育,解脂菌落就可以在棉纸中产生蓝带. 分解解脂细菌的培育基(%)为：牛肉膏0.5、蛋白胨0.5、琼脂2.0、大豆油5.0、维多利亚蓝4mg. 分别内肽酶产生菌,除了用酪蛋白作底物平板产生透亮圈进行鉴别外,还可以用吲羟乙酸酯为底物加到分别培育基中,产生蛋白酶的菌落由于水解吲羟乙酸酯为3-羟基吲哚,后者能氧化生成蓝色产物,依据呈色圈便可选出平板上产蛋白酶的菌落.培育基平板由两层组成,底层含明胶1.2,酵母汁0.1,蛋白胨0.4,琼脂1.5,待凝固后在其上掩盖一层琼脂,琼脂含量为0.7,由pH7.6的0.5mol/L的磷酸氢钾缓冲液配制,配制浓度为0.083mol/L的吲羟乙酸酯溶液,取其中的0.3ml加入到上层琼脂中倒平板. 通过平板上的变色圈还可以快速分别筛选产乙醇的菌株.在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上,掩盖一层含有盐类的琼脂,该蓝色物质在醇脱氢酶和NAD作用下(在少量乙醇存在时)反应产生的电子脱色.因此生成乙醇的菌落便显出一个淡白色的圈,晕圈的大小可初步表示乙醇的产量. 3. 生长圈法 生长圈法通常用于分别筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌.工具菌是一些相对应的养分缺陷型菌株.将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需养分物的平板上进行培育,若某菌株能合成平板所需的养分物,在该菌株的菌落四周四周便会形成一个混浊的生长圈.如嘌呤养分缺陷型大肠杆菌(如 E.coliP264)与不含嘌呤的琼脂混合倒平板,在其上涂布含菌样品保温培育,四周消失生长圈的菌落即为嘌呤产生菌. 同样,只要是筛选微生物所需养分物的产生菌时,都可采纳生长圈法,工具菌用 相应的养分缺陷型菌株,由于得到所需养分,凡是目的微生物四周便会消失混浊的生长圈. 4. 抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的分别筛选.通常抗生素的筛选要投入极大的人力、财力和时间.据估量,筛选1万个菌株才能得到1株有用的生产菌.因此设计一个精确、快速的筛选模型非常重要.抑菌圈法是常用的初筛方法,工具菌采纳抗生素的敏感菌.若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质,如抗生素等,便会在该菌落四周形成工具菌不能生长的抑菌圈,很简单被鉴别出来.采纳该方法已经得到许多有用的抗生素,如春雷霉素和青霉素等. 在青霉素菌种选育中,还可利用加入青霉素酶来筛选青霉素高产菌株,做法如下：将产黄青霉孢子进行诱变处理,致死率约为99%.分别于琼脂平板上,掌握孢子浓度,使长成单独菌落,始终培育到青霉素产量达到顶峰,加入0.106U/mol青霉素酶于鉴定菌枯草芽孢杆菌悬浮液中,铺张于菌落平板表面,凝固后,培育1720h.测量抑菌圈大小,依据有效指标(抑菌圈直径于菌落直径之比)选出高产突变株. 由于现有抗生素种类多样,得到新的抗生素越来越困难.人们除了从一些特别的 地方如极端环境中采样分别抗生素的产生菌,也采纳一些特别的筛选方法,以期从一般土样中分别筛选倒新的微生物及新的抗生素.除上述的抑菌圈外,稀释法、集中法、生物自显影法等也不同程度的得到应用.在这些方法中,检验菌的选择非常重要,直接关系到检出的灵敏度和筛选到的抗生素的活性和抗菌谱.如在筛选抗细菌抗生素时,传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为检验菌来检验抗生素的抗性.采纳联合检验菌,如枯草杆菌和绿色产色链霉菌活巴氏梭菌,可分别出抗菌活性低、对其他试验菌活性高的新抗生素,如黄色霉素族的抗生素,而这些抗生素在单独使用枯草杆菌时无法检出. 海洋是新抗生素的重要来源.很多海洋生物体内都含有微生物,这些微生物为宿主抵挡病害起着关键作用.因此,从鱼组织和虾消化道里分别筛选抗癌药物和抗炎症药物是一个有效地途径.已从水母体内筛到一种名为salinamide的抗生素,一种抗真菌抗生素istatin也从海洋生物体中分别出. 在筛选抗霉菌抗生素时,需依据其特点进行筛选,因霉菌与哺乳动物细胞性质相像,为削减药物对人体的副作用,需选择对霉菌有抗性但对人体平安的抗生素.由于哺乳动物不含几丁质,因此可先筛选抑制几丁质合成酶的生理活性物质,再从中筛选所需抗生素.三国霉素和多氧菌素就是通过该方法筛选得到的.抗病毒抗生素及抗肿瘤药物的筛选则可通过敏感细菌培育平板的噬菌斑来推断. 采纳抑菌圈法,不仅能筛选抗生素,而且还能筛选某些酶类. (四)组织分别法 组织分别法是由一些有病组织或特别组织中分别菌株的方法.如从患恶苗病的水稻组织中分别赤霉素,从根瘤中分别根瘤菌及从各种食用菌的子实体中分别孢子等. 1. 对一般有病组织的分别方法 切除小块含菌组织,用洁净水洗去组织表面污物.以10漂白粉或0.1升汞浸泡25分钟进行表面消毒,无菌水冲洗.将消毒后的组织移到平皿培育基上,置于相宜温度(2526)培育肯定时间,即可在组织四周四长出微生物.用肉眼或显微镜观看菌落,基本确认后挑入斜面培育基中培育.由这种方法选择的菌株往往不纯,必需在琼脂平板上再分别纯化,然后挑取单个菌落于斜面,进一步筛选. 从豆科植物的根瘤中分别根瘤菌：取新奇健壮的根瘤,经漂白粉或升汞溶液等进行表面消毒后,用无菌镊子将根瘤压破,取出汁液少许与分别培育基混合倒入平皿中,摊平,培育后在平板上长出菌落,经镜检观看后确认典型菌落,移入斜面. 2.食用菌孢子分别法 食用菌的孢子分别法通常有两种,即多孢子分别和单孢子分别.多孢子分别有混杂现象,不易筛选到优良稳定的菌株.因此,从育种角度最好采纳单孢子分别.两种方法的分别步骤、方法介绍如下： (1)多孢子分别法 取产量高、朵大、健壮无病并即将成熟的初生和单生子实体,用清水洗净表面污物,对子实体外有膜爱护着的菇类,如蘑菇、草菇,在0.1%0.2%升汞溶液浸泡23 min,用无菌水冲洗数次.对子实体无膜外露的平菇等,