生物化学生物化学 第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成掌握DNA的半保留复及DNA复制的起点与方向掌握原核细胞DNA的复制熟悉真核生物DNA复制特点掌握反转录作用及DNA损伤的修复了解细菌的限制修饰系统第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成【目的与要求】1964-1970 发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录 1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。 中心法则：病毒（复制）复制转录DNA RNA 蛋白质翻译逆转录RNA的复制存在于RNA病毒 DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成1964-1970 发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录 1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。 中心法则：病毒（复制）复制转录DNA RNA 蛋白质翻译逆转录RNA的复制存在于RNA病毒第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成Reverse transcription中心法则图示一、DNA的半保留复制2.半保留复制的实验证据:1.定义： 1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。 以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成DNA复制的可能方式全保留与全新复制分散复制半保留复制DNA半保留复制图示： 半保留复制的证明： Meselson 和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图DNA的半保留复制的生物学意义： DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。 DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成双向复制单向复制二、DNA复制的起点与方向复制中的DNA 复制原点复制叉第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成DNA复制的主要方式 大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制） 真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成DNA复制的主要方式3 不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步） 单向滚环式复制（噬菌体X174DNA单链环状）第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成三、原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成)n原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)n需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。3 -OH. DNA聚合酶：该酶的催化性质如下：第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成 原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成)n 需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆 菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3 -OH. n合成方向：5 3 DNA聚合酶：该酶的催化性质如下：第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成（1）5 3 聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）； （2）3 5外切酶活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；1、DNA聚合酶:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成（3）还具有5 3外切酶活性（双链有效）；DNA聚合酶:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有: 该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口的填补。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成Arthur Kornberg 1918 Stanford University Stanford, CA, USA The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成2、DNA聚合酶和DNA聚合酶：DNA聚合酶:多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3 5外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成 DNA聚合酶: 多亚基酶，含十种亚基:（），其中（）称为核心酶，2称为夹子，（2）组成复合物，其主要功能是帮助亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成DNA聚合酶的异二聚体前导链的合成滞后链的合成 DNA聚合酶的-钳子俯视图DNA双螺旋DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶结构基因不同种类的亚基数目相对分子质量35外切酶53外切酶聚合速度（核苷酸/分）持续合成能力功能Pol A1103,0001,000-1,2003-200切除引物，修复Pol B788,0002,4001,500修复Pol C10830,00015,000-60,000500,000复制 大肠杆菌三种DNA聚合酶比较第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成3、双链DNA复制的分子机制前导链滞后链冈崎片段前导链：以3 5 方向的亲代链为模板连续合成的子代链。滞后链：以5 3方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。(1)冈崎片段和半不连续复制 同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬菌体感染的大肠杆菌 短时间内分离的DNA均为DNA小片段一段时间后检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶的缺失的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。证明DNA复制中有小片段合成。 1968日本学者冈崎：第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成冈崎片段和半不连续复制 测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于U替代dT渗入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。 在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，DNA的U不再被切除，则检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。 1968日本学者冈崎：第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成(2)冈崎片段的RNA引物 DNA复制时不仅需要四种dNTP前体，还需要一个与模板DNA碱基顺序互补的RNA短片（约10bp）段当作引物。 RNA引物的合成称引发，由引物体完成。引物体由引物合成酶和另外几种蛋白质共同组成。它可以沿模板链向分叉的方向前进，并断断续续地引发生成后随链的引物RNA短链第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成引物合成酶与引发前体 引物合成酶：催化引物RNA的生成 引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n、n和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。 第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成 引发体可以沿模板链5 3方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量， n蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。引物合成酶与引发前体第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成(3)DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点： 大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成(4)母本DNA双链的分离 拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。 除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成 拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。 拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。两类拓扑异构酶作用特点: 二者共同控制DNA的拓扑结构。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成解螺旋酶 （解链酶） 通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。 稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。单链结合蛋白：第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成(5). DNA复制的精确性（高保真复制） DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/1091/1010，即每1091010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制100010000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成1、碱基的配对规律：模板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。3、DNA的损伤修复系统。第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能相对分子量（103）分子/细胞DNA旋转酶（或拓扑异构酶）DNA解链酶单链结合蛋白引物合成酶DNA聚合酶引入或松开超螺旋使双链DNA解链稳定单链区合成RNA引物除去引物并填满缺口40065746010950300100300第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图小结:DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例） 复制的终止： 复制的起始起始复合物的形成：称为引发RNA引物的合成 链的延伸：第十二章第十二章 核酸的生物合成核酸的生物合成复制原点oriC和原点的识别： DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori C(或o）表示。大肠杆菌的复制原点ori C由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。复制原点oriC和原点的识别： 从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基