DNA的粗提取与鉴定 海安李堡中学 张云 无论是果胶酶还是加酶洗衣粉中的酶制剂，都是从细胞中提取出来的。从今天开始，我们学习生物化学成分的提取与改造技术。基础知识： DNA粗提取的原理 提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？提取DNA的原理包括DNA的溶解性和耐受性两个方面。DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。思考1分析图51。DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？要使DNA溶解，需要使用什么浓度？要使DNA析出，又需要使用什么浓度？ 在0.14mol/L时溶解度最小；较高浓度可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA析出。 思考2 在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特别是95冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。问：采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？将DNA和蛋白质进一步分离思考3 提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。温度值为6080，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。补充：DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95。 DNA的鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定？在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色原理总结。通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA 1实验材料 不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为教材提供的材料中哪些不适合提取DNA？ 从核DNA数目来看，猪38条，鸡78条，哺乳动物血0条，猕猴桃58条，洋葱16条，豌豆14条，菠菜12条，大肠杆菌1条。请选择动植物材料各一种。哺乳动物的血液和液体培养基中的大肠杆菌。鸡血、猕猴桃。 2 破碎细胞，获取含DNA的滤液 若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液？ 在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。 在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？ 具体做法。10mL鸡血20mL蒸馏水同方向搅拌3层尼龙布过滤滤液破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA的提取量减少 3 去除滤液中的杂质 最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。阅读教材提供的三种方法，分析其中的原理。 方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同； 方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA； 方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。 具体做法。 方案一：30mL滤液35gNaCl同方向搅拌，DNA溶解加入蒸馏水DNA析出过滤得到过滤物放到2mol/LNaCl溶液中溶解DNA-NaCl溶解液 方案二：30mL滤液嫩肉粉（木瓜蛋白酶）静置1015分钟DNA滤液 方案三：30滤液6067处理过滤获得DNA滤液 4 DNA析出与鉴定 在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？ 滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置23分钟，析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。 怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢？阅读教材。 阅读。简述DNA的鉴定过程。 具体做法。试管2支，编号甲乙各加等量5mLNaCl溶液甲中放入少量白色丝状物，使之溶解各加4mL二苯胺，混合均匀沸水浴5min观察颜色变化 3实验操作 制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心 破碎细胞，释放DNA 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌 过滤，除去细胞壁、细胞膜等。 溶解核内DNA 加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌 DNA析出 加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中 除去细胞质中的大部分物质。 DNA初步纯化 与等体积95冷却酒精混合，析出白色丝状物 除去核蛋白、RNA、多糖等。 DNA鉴定 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色 其它注意事项： 在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。为了提高DNA纯度，在科学实验中通常使用的洗涤剂有十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）。