根底兽医学专业优秀论文 羊痒病免疫组织化学检测方法建立及区分牛、羊PrP的单抗2H3的特性研究关键词：免疫组化 羊痒病 单克隆抗体 组织病理学摘要：羊痒病的检测方法为单克隆抗体介导的免疫学反响，包括ELISA、western blotting和免疫组织化学(IHC)等方法，同时结合脑组织组织病理学观察。本研究通过大肠杆菌融合表达PrP27-30蛋白，制备特异性单克隆抗体，初步寻找单克隆抗体抗原结合位点，对所得单克隆抗体进行免疫学特性分析，选取最正确单克隆抗体，建立我国的羊痒病免疫组化检测方法，并对我国局部地区采集样品进行普查，在我国羊痒病的监测方面做了比拟系统的工作；另外本研究利用突变技术突变单抗2H3结合位点，首次提出并证明羊PrP208位点在不同物种间存在I/M的多态性，这一多态性导致2H3单抗对不同物种PrP亲和力存在差异。 本实验利用PCR方法从小尾寒羊基因组DNA中扩增PrP27-30编码基因，并克隆到硫氧复原蛋白融合表达载体pET32a上，转化至E. collBL21，IPTG诱导融合表达，得到相对分子质量约为35kD的重组小尾寒羊PrP27-30融合蛋白。以纯化的重组小尾寒羊PrP27-30融合蛋白免疫PrP<'c>基因敲除小鼠，经过两次加强免疫，通过淋巴细胞杂交瘤技术，取脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备出抗小尾寒羊PrP27-30单克隆抗体，经三次亚克隆，筛选出六株能稳定分泌针对小尾寒羊PrP27-30特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 利用大肠杆菌原核表达系统，以相邻肽段间每间隔15个氨基酸(PrP-peptide 2除外)，共6段肽段来分段表达小尾寒羊PrP27-30，分别命名为PrP-peptide 1、PrP-peptide 2、PrP-peptide 3、PrP-peptide 4、PrP-peptide 5和PrP-peptide 6。将6段融合蛋白分别与羊痒病单克隆抗体进行Western blotting反响，根据反响情况分析单克隆抗体抗原结合位点的大概位置，初步得到了待检5株羊痒病单克隆抗体的抗原结合位点，其所在位置分别为：2H3在199aa-213aa之间、4C6在153aa-154aa左右、5F11在154aa-168aa之间、7F1在214aa-227aa之间、7F11在154aa-168aa之间。 对2H3、4C6、5F11和7F11四株单克隆抗体与牛、羊PrP<'c>的ELISA反响特性，与牛和羊PrP<'c>和PrP<'Sc>的Western blotting、免疫组化反响特性等几个方面进行了详细的鉴定和分析。结果显示，2H3对羊PrP<'c>和PrP<'sc>显示了较强的反响性，对牛PrP<'c>和PrP<'sc>无反响；4C6对牛和羊PrP<'c>和PrP<'sc>都有较强反响性；5F11和7F11显示出相似的反响特性，对羊PrP<'c>和PrP<'sc>反响性较强，而对牛PrP<'c>和PrP<'sc>次之，抗原结合位点结果与单抗的反响特性相一致。比拟清楚的了解了四株单抗的免疫学特性，为每株单抗供不同用途使用提供了理论依据。根据单抗2H3免疫学特性，利用NCBI中BLAST功能比对单抗结合抗原区段氨基酸的差异，发现羊PrP208位点表现有种属特异性，推测此位点可能影响2H3免疫学特性；利用大肠杆菌原核表达系统表达含有2H3单抗结合区段的PrP肽段，在PCR引物中引入突变，将小尾寒羊PrP208位点的异亮氨酸I突变为牛PrP208位点蛋氨酸M，与未引入突变的同一段小尾寒羊PrP肽段一起与2H3进行Western blotting反响，结果显示2H3不与突变后的PrP肽段发生反响，但与未引入突变的同一肽段发生反响。结果说明，2H3的主要抗原结合位点为羊208位点的I，此位点的种属差异是造成2H3单抗具有免疫学特性的原因，结果同时也说明2H3在动物朊毒体蛋白研究上具有特殊意义。 在以上研究的根底上，本实验以自制单抗为核心试剂，优化各步骤反响的最正确条件，建立具有我国自主知识产权的羊痒病免疫组化检测方法，并采集我国局部省、市、自治区羊脑样品，利用建立的羊痒病免疫组化检测方法对我国羊痒病进行普查。在2005年检测的3211头份样品和2006年检测的1711头份样品中，所有4922头份检测样品均显示为阴性，初步说明我国目前尚无羊痒病的发生。正文内容 羊痒病的检测方法为单克隆抗体介导的免疫学反响，包括ELISA、western blotting和免疫组织化学(IHC)等方法，同时结合脑组织组织病理学观察。本研究通过大肠杆菌融合表达PrP27-30蛋白，制备特异性单克隆抗体，初步寻找单克隆抗体抗原结合位点，对所得单克隆抗体进行免疫学特性分析，选取最正确单克隆抗体，建立我国的羊痒病免疫组化检测方法，并对我国局部地区采集样品进行普查，在我国羊痒病的监测方面做了比拟系统的工作；另外本研究利用突变技术突变单抗2H3结合位点，首次提出并证明羊PrP208位点在不同物种间存在I/M的多态性，这一多态性导致2H3单抗对不同物种PrP亲和力存在差异。 本实验利用PCR方法从小尾寒羊基因组DNA中扩增PrP27-30编码基因，并克隆到硫氧复原蛋白融合表达载体pET32a上，转化至E. collBL21，IPTG诱导融合表达，得到相对分子质量约为35kD的重组小尾寒羊PrP27-30融合蛋白。以纯化的重组小尾寒羊PrP27-30融合蛋白免疫PrP<'c>基因敲除小鼠，经过两次加强免疫，通过淋巴细胞杂交瘤技术，取脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备出抗小尾寒羊PrP27-30单克隆抗体，经三次亚克隆，筛选出六株能稳定分泌针对小尾寒羊PrP27-30特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 利用大肠杆菌原核表达系统，以相邻肽段间每间隔15个氨基酸(PrP-peptide 2除外)，共6段肽段来分段表达小尾寒羊PrP27-30，分别命名为PrP-peptide 1、PrP-peptide 2、PrP-peptide 3、PrP-peptide 4、PrP-peptide 5和PrP-peptide 6。将6段融合蛋白分别与羊痒病单克隆抗体进行Western blotting反响，根据反响情况分析单克隆抗体抗原结合位点的大概位置，初步得到了待检5株羊痒病单克隆抗体的抗原结合位点，其所在位置分别为：2H3在199aa-213aa之间、4C6在153aa-154aa左右、5F11在154aa-168aa之间、7F1在214aa-227aa之间、7F11在154aa-168aa之间。 对2H3、4C6、5F11和7F11四株单克隆抗体与牛、羊PrP<'c>的ELISA反响特性，与牛和羊PrP<'c>和PrP<'Sc>的Western blotting、免疫组化反响特性等几个方面进行了详细的鉴定和分析。结果显示，2H3对羊PrP<'c>和PrP<'sc>显示了较强的反响性，对牛PrP<'c>和PrP<'sc>无反响；4C6对牛和羊PrP<'c>和PrP<'sc>都有较强反响性；5F11和7F11显示出相似的反响特性，对羊PrP<'c>和PrP<'sc>反响性较强，而对牛PrP<'c>和PrP<'sc>次之，抗原结合位点结果与单抗的反响特性相一致。比拟清楚的了解了四株单抗的免疫学特性，为每株单抗供不同用途使用提供了理论依据。根据单抗2H3免疫学特性，利用NCBI中BLAST功能比对单抗结合抗原区段氨基酸的差异，发现羊PrP208位点表现有种属特异性，推测此位点可能影响2H3免疫学特性；利用大肠杆菌原核表达系统表达含有2H3单抗结合区段的PrP肽段，在PCR引物中引入突变，将小尾寒羊PrP208位点的异亮氨酸I突变为牛PrP208位点蛋氨酸M，与未引入突变的同一段小尾寒羊PrP肽段一起与2H3进行Western blotting反响，结果显示2H3不与突变后的PrP肽段发生反响，但与未引入突变的同一肽段发生反响。结果说明，2H3的主要抗原结合位点为羊208位点的I，此位点的种属差异是造成2H3单抗具有免疫学特性的原因，结果同时也说明2H3在动物朊毒体蛋白研究上具有特殊意义。 在以上研究的根底上，本实验以自制单抗为核心试剂，优化各步骤反响的最正确条件，建立具有我国自主知识产权的羊痒病免疫组化检测方法，并采集我国局部省、市、自治区羊脑样品，利用建立的羊痒病免疫组化检测方法对我国羊痒病进行普查。在2005年检测的3211头份样品和2006年检测的1711头份样品中，所有4922头份检测样品均显示为阴性，初步说明我国目前尚无羊痒病的发生。羊痒病的检测方法为单克隆抗体介导的免疫学反响，包括ELISA、western blotting和免疫组织化学(IHC)等方法，同时结合脑组织组织病理学观察。本研究通过大肠杆菌融合表达PrP27-30蛋白，制备特异性单克隆抗体，初步寻找单克隆抗体抗原结合位点，对所得单克隆抗体进行免疫学特性分析，选取最正确单克隆抗体，建立我国的羊痒病免疫组化检测方法，并对我国局部地区采集样品进行普查，在我国羊痒病的监测方面做了比拟系统的工作；另外本研究利用突变技术突变单抗2H3结合位点，首次提出并证明羊PrP208位点在不同物种间存在I/M的多态性，这一多态性导致2H3单抗对不同物种PrP亲和力存在差异。 本实验利用PCR方法从小尾寒羊基因组DNA中扩增PrP27-30编码基因，并克隆到硫氧复原蛋白融合表达载体pET32a上，转化至E. collBL21，IPTG诱导融合表达，得到相对分子质量约为35kD的重组小尾寒羊PrP27-30融合蛋白。以纯化的重组小尾寒羊PrP27-30融合蛋白免疫PrP<'c>基因敲除小鼠，经过两次加强免疫，通过淋巴细胞杂交瘤技术，取脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备出抗小尾寒羊PrP27-30单克隆抗体，经三次亚克隆，筛选出六株能稳定分泌针对小尾寒羊PrP27-30特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 利用大肠杆菌原核表达系统，以相邻肽段间每间隔15个氨基酸(PrP-peptide 2除外)，共6段肽段来分段表达小尾寒羊PrP27-30，分别命名为PrP-peptide 1、PrP-peptide 2、PrP-peptide 3、PrP-peptide 4、PrP-peptide 5和PrP-peptide 6。将6段融合蛋白分别与羊痒病单克隆抗体进行Western