浅论兔局灶性脑缺血微导丝法预处理模型的建立【摘要】目的：探讨稳定的兔局灶性脑缺血预处理微导丝法模型的建立及对其评价。方法：健康新西兰白兔35只，随机分为3组:假手术组5只；缺血组10只，在DSA引导下，选择微导丝直接从颈总动脉(CCA)经颈内动脉(ICA)插至大脑中动脉(MCA网始部4h,再灌注时，抽回导丝至颈总动脉内；预处理组20只，在DSA引导下，选择微导丝从颈总动脉经颈内动脉插至MCA起始部停留15min，再灌注时，抽回导丝至颈总动脉内停留15min,如此重复3次，之后将微导丝堵于大脑中动脉起始部4h,完成微导丝法局灶性脑缺血预处理模型的制作，并利用神经功能缺损评分、TTC和HE染色对模型进行评价。并且对模型行MRI常规扫描及弥散成像，分析MRI是否也能显示脑缺血预处理的存在。结果：血管造影可清晰显示颈内动脉的走行及其颅内分支情况，8只动物缺血模型成功，12只动物脑缺血预处理模型成功。缺血/再灌注后3h就可在T2WI,DWI表现为右侧海马及外侧基底节区高信号，DWI范围大于T2WI,于24hT2WI范围基本不变且T2WI与DWI范围相近。TTC染色将正常组织染成红色，梗死脑组织不染色而呈白色，不染色的范围与导丝栓塞后T2WI上的病变范围基本一致，预处理组最终T2WI上高信号区及TTC无染区体积均小于缺血组。结论：采用微导丝直接从颈总动脉经颈内动脉插至MC建始部，栓塞15min后，抽回导丝至颈总动脉内再灌注15min,如此反复3次，能建立较稳定的脑缺血预处理模型。【关键词】缺血预处理磁共振动物模型兔IAbstractObjective:Toinvestigatereproducibilityofintraluminalthreadapproachinmakingfocalcerebralischemia/reperfusionpreconditioningmodelinrabbits.Methods:Thirtyfiverabbitswererandomlydividedintothreegroups:Controlgroup(n=5)wasshamoperated.Ischemiacgroup(n=10),focalcerebralischemia/reperfusionmodelwasmadeunderDSAbyinsertingawireintoMCAthroughICAandCCAdirectlyandpullingitout4hourslater.Themethodofpreconditioninggroup(n=20)wassimilartothatofischemiacgroup,justpullingthewireout15minutesandpushingitin15minutes,3timesrepeatly,thenpullingitout4hourslater.Neurologicaldeficitscore,TTCandHEwereusedtoevaluatetheeffectivenessofcouldMRIconfirmtheexistenceofpreconditioningtoo?Results:ThecourseandbifurcationofICAcouldbedisplayedclearlyontheangiography.Eightintenofischemiacgroupandtwelveintwentyofpreconditioninggroup(sixtypercent)weresuccessfulmodels.HighsignalwasseenonDWIandT2WI3hafterischemia/reperfusion.WhiteareaofTTCmatchedthehighsignareaofT2WI,buttheinfarctionvolumeofpreconditioninggroupwaslessthanischemiaxgroup.ConclusionFocalCerebralischemiapreconditioningmodelmadebyinsertingawireintoMCAthroughICAandCCAdirectlyandpullingitout15minutesandpushingitin15minutes,3timesrepeatlywasstableandfitforimagingresearch.IKeywordsischemiac;preconditioning;MRI;animalmodel;rabbit众所周知，短暂性脑缺血发作是发生缺血性卒中的危险因素之一。但近年来有文献指出，给予动物短暂性全脑或局灶缺血对间隔一定时间后的严重脑缺血有一定保护作用，不仅可使缺血再灌注损伤体积缩小，而且可使神经功能缺损减轻，此即“脑缺血耐受”1-2。TIA可否作为一种缺血预处理方式来保护缺血再灌注损伤的脑组织？临床上用诱发TIA作为一种治疗缺血性卒中的措施要冒引起严重脑组织损伤的危险，而且也不现实。因此，我们通过建立缺血预处理模型来研究缺血耐受机制，以期发现一种更好、更稳定的预处理方法。1材料与方法实验动物及分组健康新西兰白兔35只，雌雄不限，体质量kg,自由进食和饮水，12h昼夜节律喂养。所有动物随机分为3组：假手术组5只，显露颈总动脉4h后关闭颈部，不做其他任何处理；缺血组10只，直接将微导丝从颈总动脉经颈内动脉（ICA）插至大脑中动脉（MCA）起始部4h。预处理组20只，方法同缺血组，将微导丝堵塞15min，再灌时，抽回导丝至颈总动脉内15min,如此重复3次，之后导丝堵于大脑中动脉起始部4h。微导丝的制备根据预实验选择头端直径为mm的导丝（Terumo,日本）,自头端截取导丝10cm,紫外线消毒后置于1%干素溶液中备用。动物模型的制作术前动物禁食24h,3%戊巴比妥钠下扫描获得颈内动脉及大脑前、中、后动脉的图像，缓慢向颈总动脉插入微导丝，在DSA下观察导丝走行，经颈内动脉插至大脑中动脉起始部，当导丝头端接近大脑中动脉起始部时，放慢速度，动作轻柔，遇阻力时观察导丝头端位置，再次注入对比剂，如大脑中动脉血流被阻断即表明导丝头端已到达大脑中动脉起始部。将导丝与颈总动脉结扎固定，防止移动和出血。记录时间作为大脑中动脉阻塞开始时间，逐层缝合颈部切口，留置剩余导丝，于体外再灌时抽回导丝至颈总动脉内。图1大脑中动脉栓塞的DSA图像Fig1MCAOonDSA模型成功的标准动物存活，手术操作顺利，术中无大出血，麻醉反应正常，兔清醒后出现左侧肢体不同程度的偏瘫。TTC染色右侧出现不同程度无红染区及HE染色出现病理改变为模型成功的标准。未成功的实验动物，在完成所需检查或死亡后开颅取脑观察，寻找不成功或死亡原因。神经功能缺损体征评分方法参考Kilic等3的报道，即5级评分法：0-正常运动功能；1-动物的躯干和病灶对侧前肢呈屈曲状态；2-动物行走时向病灶对侧作转圈运动，但在安静休息时姿势正常；3-在安静休息时动物姿势倒向病灶对侧，不能站立；4-没有自发的运动动作。MRI检查微导丝栓塞大脑中动脉4h后，于再灌注1,3,6,12,24h行MRI扫描。采用西门子MagnetomTrioTimMR描仪，动物仰卧于头线圈中央，在定位相上取视交叉平面为中心层面，行冠状位连续扫描，层厚4mm,层间距mm部分扫描参数如下：T1WI:TR500ms,TE83ms,FOV100mm100mm矩阵256X256;T2WI:TR3000ms,TE82ms,FOV100mnX100mm矩阵256X256;DWI:TR3000ms,TE97ms,在X,Y,Z轴三个方向分别施加扩散敏感梯度，FOV100mm100mm,矩阵256X256。组织病理染色在最后一次M唯查结束后立即用戊巴比妥钠过量麻醉将兔处死，完整取出大脑，置于冰箱中冷藏。1520min后取出兔脑，沿冠状面均匀切成4mm厚的脑片。脑片迅速放入2%TTC生理盐水溶液中，置入37C恒温水浴箱避光反应30min，取出后用10%甲醛溶液反复多次置换，固定24h后进行HE染色。2结果血管造影血管造影可清晰显示颈内动脉的走行及其颅内分支情况，如大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉及椎基底动脉。此外由于导丝不透X线，还可在透视下观察其位置，准确定位。当微导丝头端到达大脑中动脉起始部时注入对比剂，发现对比剂无法进入大脑中动脉，即大脑中动脉血流被完全阻断。缺血组10只兔中1只因麻醉过量死亡，1只因导丝进入颈内动脉时发生痉挛，利多卡因治疗后5min仍无法缓解而被去除，成功率为80%预处理组20只兔，3只因麻醉过量死亡，2只因导丝进入颈内动脉时发生痉挛，利多卡因治疗后5min仍无法缓解而被去除，2只于缺血后4h内死亡，1只于预处理过程中死亡，MRI及TTGHE染色未见异常，成功率为60%MRI表现假手术组M知描未发现明显异常。缺血组于缺血4h再灌注624h后行连续MRI检查，缺血/再灌注后3h就可在T2WI,DWI表现为右侧海马及外侧基底节区高信号，DWI范围大于T2WI,T1WI表现为稍低信号，之后信号范围逐渐扩大。于24hT2WI范围基本不变且T2WI与DWI范围相近。TTC染色将正常组织染成红色，梗死脑组织不染色而呈白色，不染色的范围与导丝栓塞后T2WI上的病变范围基本一致（图2,图3）。预处理组处理后，亦再灌注624h。其中10只3hT2WI,DWI上亦可见右侧高信号区，之后范围渐扩大，但24hT2WI不再变化的范围较小及边缘模糊，2只24h仍不出现异常信号。出现信号改变的10只动物TTC染色基本为红色，仅小部分区域不着色，仍与T2WI高信号区对应；2只不出现信号改变的TTC染色为均质红染。最终T2WI高信号区体积即梗死体积及平均梗死面积比较，缺血组大于预处理组，且分别与之对应TTC染色后无红染区体积与平均无红染面积相符。表1缺血组与预处理组最终梗死体积及平均梗死面积大体及组织病理表现假手术组大体标本、TTC染色及HE染色均未见明显异常。缺血组、预处理组大体标本梗死区颜色较正常侧白，可见因导丝插入梗死半球的颜色较对侧白，留下少许血迹，触感似豆腐渣。HE染色示梗死区部分核碎裂，不能显示完整的细胞核，神经元结构模糊，轴突结构不清。神经功能缺损评分缺血组脑缺血/再灌注后神经功能缺损评分多在23级，主要表现为向左侧倾倒，通常无意识状态的改变。预处理组神经功能缺损评分多在01级，明显低于缺血组。3讨论模型的制作目前有多种方法制作大脑中动脉缺血模型。经眶入路结扎或夹闭大脑中动脉起始部由于手术损伤大，术中出血多以及磁共振研究时伪影影响实验结果，近年来基本被线栓法取代。孔令琦等:4研究了如何提高线栓法制作大脑中动脉局灶性兔脑缺血模型的稳定性和可重复性的问题。我们在模型的制作中对其进行了借鉴，并做了一些改进，只需分离出一段长约10mm的颈总动脉，直接从颈总动脉经颈内动脉插至起始部，不用返折颈外动脉与颈内动脉成一直线，再灌时，抽回导丝至颈总动脉内即可。导丝具有一定的韧性，而且头端圆滑稍弯曲，直径大小恒定便于控制，更易通过颈动脉孔及颈内动脉虹吸段。此外，还可在透视下观察导丝的位置。造模失败主要原因主要有以下3种。麻醉意外。我们的经验是首次注射量要足，因为二次追加极易引起麻醉过量死亡，剂量很难控制；另外，当麻药剂量接近致死量时，注射速度要相当缓慢，注意观察呼吸，一旦呼吸停止立即复苏。手术意外。手术时尽量避免牵拉、刺激迷走神经和气管。兔子血管变异大，如果显露有困难，应另辟路径。血管痉挛。无论显露血管时或导丝插入时刺激血管都易引起痉挛，阻碍导丝继续前行。可用利多卡因解痉，5min后仍无法缓解者，本实验将其剔除。插导丝时动作缓慢、轻柔可减少血管痉挛发生。MRI评价TIA近