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大肠杆菌实验诊断研究进展详解演示文稿1页,共43页,星期一。(优选)大肠杆菌实验诊断研究进展2页,共43页,星期一。大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎:鲜血样便,腹部痉挛性疼痛,低热或不发热。 溶血性尿毒综合征(HUS):主要发生在儿童,常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%,各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜(TTP):主要发生在成年人,尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状,病情发展迅速,病死率高,有时可出现70%的病人死亡。 3页,共43页,星期一。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌,可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室,大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观我国情况也不容乐观4页,共43页,星期一。一、细菌培养与鉴定 1分离培养分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者,其次是HUS、TTP等住院病人,再其次是高危接触者。培养基:培养基:山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39(MSD)琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂(TC-SMAC)添加了头孢克肟和鼠李糖(0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂(CR-SMAC)“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清山梨醇发酵培养基 5页,共43页,星期一。增菌液增菌液:含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L 6页,共43页,星期一。2免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37培养6-24小时,挑取可疑菌落进行鉴定。7页,共43页,星期一。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离,并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法(IMS)检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。8页,共43页,星期一。 目前,污染的肉、家畜,甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为1001000 cfu/lm,在食品检出的范围为10002000cfu/lm ,检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份(8.2%)84份中有23份(27.4%)由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CRSMAC分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。用含吐温20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 9页,共43页,星期一。3生化反应生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下:动力试验(+) 葡萄糖(+) 麦芽糖(+)甘露醇(+) 蔗糖(/+) 硫化氢() 尿素() 靛基质(+) 甲基红(+) V-P试验()枸橼酸盐()苯丙氨酸脱羧酶()赖氨酸脱羧酶(+/)鸟氨酸脱羧酶( +/ )氧化酶()氰化钾()与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 10页,共43页,星期一。二血清学检测二血清学检测1玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4免疫荧光技术5胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法11页,共43页,星期一。1玻片凝集试验玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确,但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。12页,共43页,星期一。2. 2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今,在免疫测定中,金标记常与膜载体配合,形成特定模式,典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等,已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法,氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。13页,共43页,星期一。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体,利用了微孔膜的毛细管作用,滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移,犹如层析一样。阴性:出现一条线 阳性:出现两条线 无效:无线14页,共43页,星期一。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点,研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡,通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比,最低测菌量为少于100个菌细胞,主要特点是敏感性高,可用于待检样品初筛,阳性样品可进行细菌分离,减少工作量。15页,共43页,星期一。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为98.9%。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法,尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。16页,共43页,星期一。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 :H11外,未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性,可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。17页,共43页,星期一。4免疫荧光技术免疫荧光技术 DEFT 与与Ab-DEFT: 直接荧光技术(DEFT)与抗体定位荧光技术(AbDEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 18页,共43页,星期一。固相荧光毛细管免疫分析固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感,具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。 O157: H7生物素抗体亲和素Cy5样品19页,共43页,星期一。直接免疫荧光抗体染色直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间2h。20页,共43页,星期一。5胶乳凝集胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上,滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 21页,共43页,星期一。6间接血凝分析间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速(3h)的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。22页,共43页,星期一。7. 全自动抗原抗体检测系统全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理:采用酶联免疫(夹心法)原理,并在底物中掺入荧光物质,最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素,荧光强弱与标本中被测物浓度相关,经扫描样
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