细胞工程 细胞工程是指应用细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地平上的操作，有目的地获得细胞、组织、器官、获得细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综个体或其产品的一门综合性的生物工程。合性的生物工程。1.原理方法：_；2.操作水平：_；3.目的：_；4.分类：_；细胞生物学、分子生物学和发育生物学细胞器、细胞或组织水平获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品植物细胞工程、动物细胞工程 第二章细胞工程植物细胞工程发展历程植物细胞工程发展历程哈伯兰特哈伯兰特提出了提出了细胞全能性细胞全能性的理论的理论，但相关的实验，但相关的实验尝试没有成功。尝试没有成功。斯图尔德斯图尔德等发现等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。细胞全能性理论提供了强有力的支持。科金科金用真菌纤维素酶分解番茄根细胞壁，获得了用真菌纤维素酶分解番茄根细胞壁，获得了原生质体原生质体。古哈等古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的中的花粉粒发育而来的胚花粉粒发育而来的胚。卡尔森卡尔森诱导烟草诱导烟草种间原生质体融合种间原生质体融合，获得了第一株体，获得了第一株体细胞细胞种间杂种植株种间杂种植株。土壤农杆菌的土壤农杆菌的TiTi质粒质粒被发现。之后，该质粒应被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。程与分子生物学技术的紧密结合。19021902年年19581958年年19601960年年19641964年年19711971年年19741974年年植物细胞工程的基本技术 兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方式，又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。 如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。从社会中来选取多上健康、饱满的叶片。平躺放在沙床上，叶片间隔相聚23厘米。约23周后生根，或从叶基处长出不定芽。叶插成功多肉进行叶插繁殖多肉进行叶插繁殖为什么多肉叶片能发育成植株？为什么多肉叶片能发育成植株？一.植物细胞工程的基本技术理论基础植物细胞的全能性定义：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。分裂 分化生物个体或其他细胞细胞已分化细胞高度分化的细胞仍含有该物种的全部遗传信息，具有发育成完整个体所需要的全套基因。原因：全能性的大小分析 A.体细胞全能性与细胞分化程度： B.体细胞全能性与细胞分裂能力： C.不同类型细胞的全能性： D.不同生物细胞的全能性：分化程度低的分化程度高的分裂能力强的分裂能力弱的受精卵生殖细胞体细胞；受精卵干细胞体细胞植物细胞动物细胞。体现细胞的全能性的标志：细胞 完整个体或其他各种细胞实例：A. 胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株 B. 受精卵发育成个体（动植物） C. 蜜蜂受精卵发育成工蜂，卵细胞发育成雄峰 D. 用一片叶子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株不体现细胞的全能性的实例：在生物的生长发育过程中，并不是所有的细胞都表现出全能性，比如，芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶。不体现细胞的全能性的原因：基因在特定时间、空间条件下选择性表达。一.植物细胞工程的基本技术植物细胞工程植物组织培养植物体细胞杂交接种接种外外植体植体诱导诱导愈伤愈伤组织组织诱导诱导生芽生芽诱导诱导生根生根移栽移栽成活成活去去壁壁去去壁壁融融合合 再再生生新新壁壁脱脱分分化化再再分分化化移移栽栽一、植物组织培养技术1.概念：指将离体的植物器官、组织或细胞（称为外植体）等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。2.原理：植物细胞的全能性。 细胞经过 后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。分裂和分化强调：生殖方式为无性生殖强调：生殖方式为无性生殖 分裂方式为有丝分裂分裂方式为有丝分裂一、植物组织培养技术3.过程：移栽成活外植体脱分化愈伤组织再分化根、芽等试管苗移栽完整植株分化状态分化状态未分化状态未分化状态脱分化再分化在一定的_和_ _等条件的诱导下，_的细胞_ _ _，转变成_的过程；实质 _结果：_愈伤组织的特点：_光照条件：_过程中涉及的生命活动 _激素营养已经分化失去其特有的结构和功能未分化的细胞已经分化的细胞失去其特有结构和功能，转变为未分化的细胞形成愈伤组织不定形的薄壁组织团块一般不需要光照只有细胞增殖（有丝分裂），没有细胞分化脱分化：1.外植体脱分化的难易因植物种类、器官来源及生理状况的不同而不同。一般来说，植物的花和幼嫩的组织脱分化相对较易，而植物的茎、叶等成熟的组织脱分化则较难。2.该过程添加的外源激素主要是细胞分裂素和生长素（比例适中）， 因为二者能强烈地促进愈伤组织的形成。3.无菌操作植物组织培养成功的关键。愈伤组织：细胞排列疏松且无规则、高度液泡化、呈无定形状态的薄壁细胞团。 注意：无叶绿体，可进行有丝分裂见光后愈伤组织变为绿色见光后愈伤组织变为绿色 再分化： _能重新_成_的过程实质 _结果_ _光照条件：_ 为什么？_过程中涉及的生命活动 _愈伤组织分化芽、根等器官基因的选择性表达再分化芽、根等器官，或再分化成胚状体后长出芽和根，进而发育成完整的植株需要给予适当时间和强度的光照诱导叶绿素的合成，使试管苗能够进行光合作用既有细胞增殖（有丝分裂），又有细胞分化适宜的培养条件：(细胞表现全能性的条件)（1）离体状态（2）无菌操作（3）种类齐全、比例适合的营养物质（4）植物激素（主要是生长素和细胞分裂素）诱导和调节（5）适宜的外界条件（温度、pH、光照等）脱分化结果：愈伤组织芽低高根生长素细胞分裂素胚状体胚状体： 离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。脱分化再分化过程结果需要条件决定植物脱分化、再分化的关键因素外植体愈伤组织愈伤组织幼苗形成愈伤组织形成根、芽a.离体b.适宜的营养c.生长素与细胞分裂素的比例适中d.一般不需光a.离体b.适宜的营养c.生长素与细胞分裂素的比例高或低诱导生根或生芽d.光照细胞具有全能性的原因是（）A.体细胞具有发育成完整个体的潜能B.生物体的每个细胞都具有全能性C.生物体的每个细胞都含有个体发育的全部基因D.生物体的每个细胞都是由受精卵发育成的C2.下面是将四倍体兰花的叶片通过植物组织培养形成植株的示意图，相关叙述中正确的是（）A.阶段会发生减数分裂过程B.阶段需生长素而阶段需细胞分裂素C.此过程体现植物细胞具有全能性D.此兰花的花药离体培养所得植株为二倍体四倍体兰花叶片愈伤组织胚状体植株C菊花的组织培养1.原理：植物细胞一般具有。全能性生生长素素/细胞分裂素胞分裂素结果果比比值高高(1)比比值低低(1)比比值适中适中(=1)有利于根的分化，抑制芽的形成有利于芽的分化，抑制根的形成促进愈伤组织的形成简记为：“高”根，“低”芽，“中”愈伤外植体脱分化愈伤组织再分化根、芽等试管苗移栽完整植株2.目的：1）了解植物组织培养的基本原理2）了解生长素和细胞分裂素的浓度、用量比例对菊花愈伤组织形成和分化的影响3）尝试进行植物组织培养3.材料：离体的茎尖、根尖、叶片、花药等（外植体）。4.MS培养基：水（去离子水）、无机营养（大量元素、微量元素）、有机营养（蔗糖、维生素、氨基酸）、天然附加物、植物激素（生长素、细胞分裂素等）外植体的消毒5.菊花的组织培养过程消毒与无菌水冲洗外植体的切段切割与接种切割与接种接种外植体超净工作台或接种箱超净工作台或接种箱诱导愈伤组织愈伤组织培养愈伤组织培养诱导生芽生根移栽酒精消毒30s 外植体的消毒材料： 幼嫩的菊花茎段流水冲洗 次氯酸钠溶液处理30min 无菌水清洗23次 无菌水清洗23次 用解剖刀将外植体切成0.51cm长的小段外植体的切段将消过毒的外植体置于无菌培养皿中 用无菌滤纸吸去表面的水分在酒精灯火焰旁，将外植体的1/31/2插入诱导愈伤组织的培养基中注意：接种时注意外植体的方向，不要倒插！（将“形态学上端”朝上，下端朝下）接种外植体用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记无菌操作培养基及培养条件： 激素比例1：1、置于黑暗、 提供有机碳源（蔗糖） 有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。诱导愈伤组织将接种了外植体的锥形瓶置于18-22的培养箱培养脱分化定期观察愈伤组织的生长情况培养1520d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上注意顺序，先诱导生芽，再诱导生根；该过程每日需要给予适当时间和强度的光照！诱导生芽生根长出芽后，将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。移栽移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日用流水清洗掉根部的培养基将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。外植体的消毒消毒与无菌水冲洗外植体的切段切割与接种切割与接种接种外植体超净工作台或接种箱超净工作台或接种箱诱导愈伤组织愈伤组织培养愈伤组织培养诱导生芽生根移栽回顾实验6.结果分析与评价： 用于植物组织培养的培养基同样适合某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。1.在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且 要求无菌操作？ 胡萝卜根形成层容易诱导成愈伤组织，其他部分如叶、花也能培养成小植株，只是稍微困难些。2.为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能培养成小植株吗？3.为什么外植体不能倒插？ 与生长素的极性运输有关； 生长素含量多的部分容易生出不定根，含量少的部分生出不定芽，一般而言，容易长不定芽的是形态学上端，容易长不定根的是形态学下端，因此应该将形态学上端朝上，下端朝下，若倒插，外植体不易存活。4. 接种34d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，试分析它们被污染的可能原因。 5. 从刚接种的外植体到长出愈伤组织需经历多少天？6. 培育的试管苗能直接移栽到露地吗？应如何操作？培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；操作过程不符合无菌操作要求等。操作过程不符合无菌操作要求等。2 2周左右周左右生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培方法。培养基质要提前又不能伤及根系。一般使用无土栽培方法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为5%5%的高锰酸钾，并用的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖塑料薄膜覆盖12h12h，掀开塑料薄膜，掀开塑料薄膜24h24h后才能移栽。新移栽的后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。组培苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。1）培养基名称： ； 2）物理性质： ；3）碳源： 。拓展1：植物组织培养常用的培养基配方 P116拓展2：植物组织培养的两种途径胚状体途径器官发生途径若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？组织培养的影响，则应如何设计对照实验？ 空白对照：不加任何激素；空白对照：不加任何激素； 实验组实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1； 实验组实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1； 实验组实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。根、芽植物