第八章第八章基因工程及其在医药工业中基因工程及其在医药工业中的应用的应用 第四节第四节 目的基因制备和常用分离方法目的基因制备和常用分离方法 一、已知基因的获得：一、已知基因的获得：（一）人工合成（一）人工合成n根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸序列，再用核苷酸序列，再用DNADNA合成仪人工合成合成仪人工合成目的基目的基因。因。n适用于合成适用于合成分子量较小分子量较小的目的基因（的目的基因（100bp100bp以内）。以内）。 （二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应（PCR）P333图8-16n1 1、定义：、定义： 又称基因又称基因体外扩增体外扩增；是在引物的介导；是在引物的介导下，通过下，通过变性、退火、延伸变性、退火、延伸三步循环反三步循环反应，体外快速的应，体外快速的DNADNA特异性扩增技术。特异性扩增技术。 PCR技术的发明者技术的发明者DNA Replication: 5 5 3 3dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPDNA-pol3TemplateTemplatePrimerPrimer5 5DNA Replication:32 2、PCRPCR反应原理反应原理n模拟体内模拟体内DNADNA复制过程复制过程，通过变性、退火、延伸三步反，通过变性、退火、延伸三步反应的循环完成，靶基因的双链应的循环完成，靶基因的双链DNADNA变性为单链变性为单链，特异的，特异的引物在退火过程中与单链引物在退火过程中与单链DNADNA模板聚合模板聚合，在靶，在靶DNADNA的指的指导下导下引物的引物的33末端延伸末端延伸靶靶DNADNA的互补链，完成一个循的互补链，完成一个循环。理论上，每一循环使环。理论上，每一循环使DNADNA分子扩增一倍，分子扩增一倍，n n次循环次循环后，后，DNADNA分子扩增为分子扩增为2 2n n；n高温变性高温变性：9494，目的基因接连为单链，以作为扩增，目的基因接连为单链，以作为扩增的模板；的模板； 低温复性低温复性：55556060，一对特异性引物分别与模板，一对特异性引物分别与模板33端互补结合；端互补结合； 适温延伸适温延伸：7272，延伸反应；，延伸反应； 5 5 Template DNA5 Primer 15 Primer 2 5 5 5 5 The 1st cycleThe 2nd cycle 5 5 5 5 5 5 5 5 平台期平台期指数扩增期指数扩增期到达平台期所需到达平台期所需PCRPCR循环次数取决于循环次数取决于模板模板拷贝数拷贝数、PCRPCR扩增效扩增效率率及及DNADNA聚合酶的种聚合酶的种类及活性类及活性. .3 3、PCRPCR产物特异性产物特异性n模板模板序列：应使用序列：应使用纯度和浓度较高纯度和浓度较高的的DNADNA模板；模板；n引物：引物：优化引物优化引物的设计的设计n使用使用较高的退火温度较高的退火温度，较少的循环较少的循环次数次数；n使用使用较低浓度的引物、酶和镁离子较低浓度的引物、酶和镁离子； 4 4、PCRPCR反应体系反应体系n模板模板：DNADNA或或RNA(RNA(逆转录合成逆转录合成cDNA)cDNA)nDNADNA聚合酶聚合酶：TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶n缓冲液系统缓冲液系统：Tris-HCl,KCl,MgTris-HCl,KCl,Mg2 2n底物底物：相同浓度的：相同浓度的dNTPdNTPn引物引物5 5、PCRPCR的主要用途的主要用途n目的基因的克隆目的基因的克隆n基因的体外突变基因的体外突变nDNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析nDNADNA序列测定序列测定n基因突变分析基因突变分析PCR仪器设备：仪器设备：n自动移液器和枪头自动移液器和枪头n微量离心管微量离心管nPCR仪仪n电泳设备电泳设备nSimple and rapid operationn Wide applicability二、未知基因获得二、未知基因获得( (一一) )基因组基因组DNADNA文库：文库：P336P336图图8 81717 采用限制酶将采用限制酶将基因组基因组DNADNA切成片段，每一切成片段，每一个个DNADNA片段都与一个载体分子拼接成重组片段都与一个载体分子拼接成重组DNADNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为增，得到的分子克隆的混合体称为“基因文库基因文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。因片段。n基因文库（基因文库（gene librarygene library）(G-(G-文库文库) )：是含有某种生物是含有某种生物全部基因随机片段全部基因随机片段的重的重组组DNADNA克隆群。克隆群。n基因文库含有基因组内全部基因片段，基因文库含有基因组内全部基因片段，包括外显子和无表达功能的内含子序列包括外显子和无表达功能的内含子序列。n每一个克隆只含有一个基因片段，应用每一个克隆只含有一个基因片段，应用时利用探针，从文库中钓取含有所需目时利用探针，从文库中钓取含有所需目的基因的克隆。的基因的克隆。 （二）（二） cDNAcDNA文库文库 将将不同细胞类型不同细胞类型或或不同阶段细不同阶段细胞的胞的mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA后后, ,将所有将所有cDNAcDNA混合体与载体进行连接后，将混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为混合体称为 cDNA cDNA文库。文库。ncDNAcDNA文库文库(C-(C-文库文库) )：是以是以mRNAmRNA合成的合成的互补互补cDNAcDNA的随机片段的随机片段的重组的重组DNADNA克隆克隆群。群。ncDNAcDNA文库文库不含内含子序列不含内含子序列，易于表达。，易于表达。n具有具有组织细胞特异性组织细胞特异性：不同组织细胞、：不同组织细胞、不同发育阶段，基因表达的情况都不不同发育阶段，基因表达的情况都不相同，应选择特异表达的细胞及状态；相同，应选择特异表达的细胞及状态；nC-C-文库比文库比G-G-文库小得多文库小得多，更容易筛选。，更容易筛选。第五节第五节 载体载体DNA与目的基因的连接与目的基因的连接 载体的选择（主要考虑以下载体的选择（主要考虑以下载体的选择（主要考虑以下载体的选择（主要考虑以下5 5 5 5个条件）个条件）个条件）个条件）足够足够足够足够容纳目的基因的容纳目的基因的容纳目的基因的容纳目的基因的幅度幅度幅度幅度根据克隆外源根据克隆外源根据克隆外源根据克隆外源DNADNADNADNA片段的大小选择合适的载体片段的大小选择合适的载体片段的大小选择合适的载体片段的大小选择合适的载体DNADNADNADNA重组体的重组体的重组体的重组体的目的目的目的目的克隆选克隆载体，表达选表达载体克隆选克隆载体，表达选表达载体克隆选克隆载体，表达选表达载体克隆选克隆载体，表达选表达载体MSCMSCMSCMSC中的中的中的中的酶切位点酶切位点酶切位点酶切位点根据克隆外源根据克隆外源根据克隆外源根据克隆外源DNADNADNADNA的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体类型类型类型类型5.5.5.5.载体克隆位点的载体克隆位点的载体克隆位点的载体克隆位点的阅读框阅读框阅读框阅读框要与目的基因的阅读框匹配要与目的基因的阅读框匹配要与目的基因的阅读框匹配要与目的基因的阅读框匹配 DNADNA分子的体外重组过程示意图分子的体外重组过程示意图一、黏性末端一、黏性末端DNA片断的连接：片断的连接：n当在当在载体载体和和目的基因目的基因上有相上有相同的限制酶酶切位点时，用同的限制酶酶切位点时，用同种限制酶（或同尾酶）使同种限制酶（或同尾酶）使二者产生二者产生相同的黏性末端相同的黏性末端，从而将二者连接。从而将二者连接。 同一种限制酶切割同一种限制酶切割同一种限制酶切割同一种限制酶切割DNADNADNADNA产生的粘性末端的连接产生的粘性末端的连接产生的粘性末端的连接产生的粘性末端的连接 G G A T C CC C T A G GB a mH 的 识 别 序列 及 切 割 部 位G G A T C CC C T A G GB a mH 含 目 的 基 因 的 D N A 片 段B a mH GC C T A G5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 G G A T C CC C T A G G G A T C C G目 的 基 因 片 段混 合 、 退 火G C C T A G G A T C C G G A T C C GG C C T A G质 粒 载 体含 目 的 基 因 的 重 组 质 粒G C C T A G G A T C C GD N A 连 接 酶1 1 、插入失活法、插入失活法（单酶切）（单酶切）n将外源目的基因插入载体选择性标记处，并使其失活。将外源目的基因插入载体选择性标记处，并使其失活。nP340P340图图8 82020n质粒质粒pBR322pBR322的抗性基因筛选示意图的抗性基因筛选示意图 插入失活示意图插入失活示意图 2 2、定向克隆法（定向克隆法（双酶切双酶切） n为实现定向克隆，可采用为实现定向克隆，可采用两种不同的限制酶同时酶两种不同的限制酶同时酶切切，使目的基因，使目的基因两端具有两端具有不同的黏性末端不同的黏性末端；定向克；定向克隆法构建重组分子隆法构建重组分子P341P341 双酶切双酶切DNADNA片段粘性末端的连接片段粘性末端的连接 G G A T C CC C T A G GB a mH B a mH B a mH G C C T A G5 3 5 3 5 5 5 3 5 3 3 G A A T T CC T T A A G A A T T C G目 的 基 因 片 段混 合 、 退 火G C T T A A G A T C C G A A T T C GG C C T A G重 组 质 粒D N A 连 接 酶Ec o RIEc o RI5 G A T C C G G C T T A A A A T T C G G C C T A G G A T C C G G C T T A AEc oR I G A T C C G G C C T A G3 5 载 体3 3、载体载体55端脱磷端脱磷法法 n载体酶切后，用载体酶切后，用APAP（碱性磷酸碱性磷酸酶）水解酶）水解55端的磷酸基团端的磷酸基团防防止载体的自身环化止载体的自身环化。n重组分子在体内修复缺口重组分子在体内修复缺口 P342图822二、平末端二、平末端DNA片断的连接：片断的连接：n在载体和目的基因上没有相同的在载体和目的基因上没有相同的限制酶酶切位点时，采用平末端限制酶酶切位点时，采用平末端连接。连接。1 1、由、由连接酶连接酶进行的连接：限制酶直进行的连接：限制酶直接切割生成平末端，或用核酸酶接切割生成平末端，或用核酸酶S1S1切去黏性末端的单链部分；切去黏性末端的单链部分；P310P310 在连接时，所用的在连接时，所用的ATPATP及及T T4 4DNADNA连接酶的浓度连接酶的浓度要比连接粘末端的要比连接粘末端的高高些些2 2、同聚物尾同聚物尾连接：连接：P343P343图图8 82323n利用末端转移酶在载体和目的基利用末端转移酶在载体和目的基因的因的3OH3OH上加上互补的同聚物上加上互补的同聚物尾尾，两者重组后，空隙由，两者重组后，空隙由DNADNA聚聚合酶合酶填补。填补。 加入同聚体尾（加入同聚体尾（homopolyme