发酵工程制药技术发酵工程制药技术任务一任务一 微生物发酵制药概述11.1 1.1 发酵制药发酵制药概念：利用制药微生物的生长繁殖，通过概念：利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵发酵，代谢合成药物，代谢合成药物，然后从中然后从中分离提取分离提取、精制纯化，获得药品的过程。、精制纯化，获得药品的过程。简史：简史：由对抗细菌性感染药物的需求驱动。（显微镜、二战等）由对抗细菌性感染药物的需求驱动。（显微镜、二战等）1928年，青霉素的发现，随后在年，青霉素的发现，随后在1940年，青霉素得到分离，疗效也被证实年，青霉素得到分离，疗效也被证实1950s，搅拌发酵技术成功应用，搅拌发酵技术成功应用1960s，形成了成熟的抗生素发酵工业，形成了成熟的抗生素发酵工业2发酵制药发酵制药- -概念与简史概念与简史342.1.1 2.1.1 发酵制药发酵制药青霉菌落青霉菌落裂解的葡萄球菌落裂解的葡萄球菌落正常的葡萄球菌落正常的葡萄球菌落透明的抑菌圈透明的抑菌圈Alexander FlemingAlexander FlemingLondon UniversityLondon University1881-19551881-1955Ernst Boris ChainErnst Boris ChainUniversity of OxfordUniversity of Oxford1906-19791906-1979Howard Walter FloreyHoward Walter FloreyUniversity of OxfordUniversity of Oxford1898-19681898-19681945年诺贝尔生理学医学奖：年诺贝尔生理学医学奖：青霉素的发现与抗感染疗效青霉素的发现与抗感染疗效51.1 1.1 发酵制药发酵制药发酵发酵- -概念与类型概念与类型概念：通过微生物培养而获得产物的过程。概念：通过微生物培养而获得产物的过程。种类：种类：基于代谢基于代谢初级代谢产物发酵和次级代谢产物发酵，过程控制相似初级代谢产物发酵和次级代谢产物发酵，过程控制相似基于供氧基于供氧好氧发酵和厌氧发酵，反应器设计相似好氧发酵和厌氧发酵，反应器设计相似基于反应基于反应生物转化发酵，生物氧化发酵，生物加氢发酵等生物转化发酵，生物氧化发酵，生物加氢发酵等基于产物基于产物青霉素发酵，维生素发酵等，实际生产中常用的分类方式青霉素发酵，维生素发酵等，实际生产中常用的分类方式61.1 1.1 发酵制药发酵制药发酵类型、产物与过程特点发酵类型、产物与过程特点发酵类型发酵类型发酵产物发酵产物过程特点过程特点厌氧厌氧初级代谢产物，维生素初级代谢产物，维生素B12产物积累多，产量高，合成途径明确产物积累多，产量高，合成途径明确好氧好氧初级代谢产物，谷氨酸，柠檬酸初级代谢产物，谷氨酸，柠檬酸产物积累多，产量较高，合成途径基本明确产物积累多，产量较高，合成途径基本明确好氧好氧次级代谢产物，抗生素次级代谢产物，抗生素产量较低，合成途径复杂产量较低，合成途径复杂好氧好氧蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶菌体向外分泌的高分子产物菌体向外分泌的高分子产物生物转化生物转化激素，氢化可的松，黄体酮激素，氢化可的松，黄体酮酶催化的脱氢、羟化等反应，非菌体代谢产物酶催化的脱氢、羟化等反应，非菌体代谢产物71.1 1.1 发酵制药发酵制药制药微生物种类制药微生物种类放线菌：链霉菌属为主，诺卡菌属较少，小单孢菌属极少；主要放线菌：链霉菌属为主，诺卡菌属较少，小单孢菌属极少；主要生产抗生素生产抗生素细菌：芽孢杆菌，棒杆菌，短杆菌；主要生产多肽类抗生素、氨细菌：芽孢杆菌，棒杆菌，短杆菌；主要生产多肽类抗生素、氨基酸和维生素等基酸和维生素等真菌：霉菌，酵母；主要生产抗生素真菌：霉菌，酵母；主要生产抗生素黄色短杆菌黄色短杆菌青霉菌青霉菌81.1 1.1 发酵制药发酵制药产物种类产物种类种类种类药物举例药物举例抗生素抗生素青霉素，链霉素，头孢菌素青霉素，链霉素，头孢菌素C C氨基酸氨基酸谷氨酸，赖氨酸，丝氨酸谷氨酸，赖氨酸，丝氨酸维生素维生素VBVB1212，VBVB2 2，VCVC核苷与核苷酸核苷与核苷酸肌苷，肌苷酸；尿苷，尿苷酸肌苷，肌苷酸；尿苷，尿苷酸酶类酶类蛋白酶，链激酶，葡激酶蛋白酶，链激酶，葡激酶酶抑制剂酶抑制剂他汀类，伏立波糖他汀类，伏立波糖免疫调节剂免疫调节剂环孢菌素环孢菌素A A，他克莫司，他克莫司91.2 1.2 发酵制药的基本过程发酵制药的基本过程基本工艺过程基本工艺过程菌种选育菌种选育种子制备种子制备发酵培养发酵培养分离纯化分离纯化产品产品上游工艺：获得制药微生物及发酵培养上游工艺：获得制药微生物及发酵培养下游工艺：发酵产物的分离纯化下游工艺：发酵产物的分离纯化10菌种选育菌种选育发酵工段发酵工段纯化工段纯化工段成品工段成品工段菌种活化菌种活化种子制备种子制备发酵控制发酵控制预处理预处理分离提取分离提取浓缩纯化浓缩纯化成品工段成品工段包装包装原料药原料药实验室、种子库实验室、种子库发酵车间发酵车间提炼车间提炼车间包装车间包装车间1.2 1.2 发酵制药的基本过程发酵制药的基本过程工段岗位与车间流程关系工段岗位与车间流程关系库存间库存间111.31.3 制药微生物生长与生产的关系制药微生物生长与生产的关系11发酵动力学研究发酵动力学研究微生物生长动力学微生物生长动力学基质利用的动力学基质利用的动力学生长与生产关系的模型生长与生产关系的模型微生物发酵过程特征微生物发酵过程特征121.3 1.3 发酵动力学研究发酵动力学研究概念：研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平概念：研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。包括生长动力学，基质消耗动力学，产物合成衡及其内在规律。包括生长动力学，基质消耗动力学，产物合成动力学。动力学。内容：发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率内容：发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系，环境因素对三者的影响，以及影响其反应速度的条的相互关系，环境因素对三者的影响，以及影响其反应速度的条件。件。意义：确定最佳发酵工艺条件，建立工艺参数控制方案，模拟使意义：确定最佳发酵工艺条件，建立工艺参数控制方案，模拟使生产控制达到最优化。生产控制达到最优化。发酵动力学发酵动力学131.3 1.3 发酵动力学研究发酵动力学研究发酵动力学的研究步骤发酵动力学的研究步骤测定发酵过程中生物、物理、化学参数动态变化。测定发酵过程中生物、物理、化学参数动态变化。将参数变化和现象与发酵代谢规律联系起来，找出它们之间的将参数变化和现象与发酵代谢规律联系起来，找出它们之间的相互关系和变化规律。相互关系和变化规律。建立数学模型，描述各参数随时间变化的关系。建立数学模型，描述各参数随时间变化的关系。计算机在线控制，反复验证模型的可行性与适用范围。计算机在线控制，反复验证模型的可行性与适用范围。141.3 1.3 发酵动力学研究发酵动力学研究已建立动力学模型的类型已建立动力学模型的类型发酵的反应过程与速度：发酵的反应过程与速度：机制模型：根据反应机制建立，几乎没有。机制模型：根据反应机制建立，几乎没有。现象模型：以经验建立模型，目前大多数都是这类。包括定量描现象模型：以经验建立模型，目前大多数都是这类。包括定量描述发酵过程、反应的主要影响因素。述发酵过程、反应的主要影响因素。151.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力学生长曲线生长曲线概念：生物量或细胞数目随时间变化的曲线。概念：生物量或细胞数目随时间变化的曲线。意义：描述微生物从生长到自溶死亡的整个过程。意义：描述微生物从生长到自溶死亡的整个过程。生长速率生长速率r r：单位时间（：单位时间（t t）内菌浓度或质量（）内菌浓度或质量（X X）的变化。）的变化。比生长速率比生长速率：单位菌体浓度或质量（：单位菌体浓度或质量（X X）的生长速率。生长速）的生长速率。生长速率的标准化，反映菌体活力大小。率的标准化，反映菌体活力大小。 测生物量测生物量 细胞数目细胞数目1.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力学测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法直接法直接法间接法间接法直接法直接法间接法间接法细细胞胞干干重重细细胞胞湿湿重重比比浊浊液液生生理理指指标标比比浊浊法法平平板板菌菌落落计计数数法法显显微微计计数数称重称重分光光度法分光光度法细胞计数板细胞计数板单菌落培养单菌落培养16用计数板在光学显微镜下直接观察并计数用计数板在光学显微镜下直接观察并计数1.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力学17平板菌落计数法平板菌落计数法1.31.3 微生物生长动力学微生物生长动力学涂布平板法涂布平板法浇注平板法浇注平板法18191.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力学菌体的生物量与时间的关系是菌体的生物量与时间的关系是S形曲线形曲线生生物物量量X延延滞滞期期 对对数数生生长长期期减减速速期期静静止止期期衰衰亡亡期期培养时间培养时间 t延滞期：基本无生长。延滞期：基本无生长。分为五个阶段分为五个阶段20菌种菌种 生长快的菌比生长缓慢的菌延滞期短。生长快的菌比生长缓慢的菌延滞期短。接种菌菌龄接种菌菌龄 采用对数生长期的菌作为接种菌可缩短延滞期。采用对数生长期的菌作为接种菌可缩短延滞期。接种量接种量 适当提高接种量可缩短延滞期。适当提高接种量可缩短延滞期。培养基成分培养基成分营养丰富，与种子培养条件接近的培养基可缩短延滞期。营养丰富，与种子培养条件接近的培养基可缩短延滞期。1.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力学影响延滞期长短的主要因素影响延滞期长短的主要因素211.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力学菌体的生物量与时间的关系是菌体的生物量与时间的关系是S形曲线形曲线生生物物量量X延延滞滞期期 对对数数生生长长期期减减速速期期静静止止期期衰衰亡亡期期培养时间培养时间 t延滞期：基本无生长。延滞期：基本无生长。指数期指数期/对数生长期：对数生长期：分为五个阶段分为五个阶段1.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力学影响指数期微生物代时长短的主要因素影响指数期微生物代时长短的主要因素菌种菌种 原核比真核短，小的真核比大的真核短。原核比真核短，小的真核比大的真核短。营养成分营养成分营养物浓度营养物浓度 生长限制因子（生长限制因子（growth-limited facter）培养温度培养温度22代时（代时（G）：1个细胞分裂为个细胞分裂为2个所需要的时间。指数期代时个所需要的时间。指数期代时G最短。最短。231.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力学菌体的生物量与时间的关系是菌体的生物量与时间的关系是S形曲线形曲线生生物物量量X延延滞滞期期 对对数数生生长长期期减减速速期期静静止止期期衰衰亡亡期期培养时间培养时间 t延滞期：基本无生长。延滞期：基本无生长。指数期指数期/对数生长期：对数生长期：减速期：减速期：分为五个阶段分为五个阶段241.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力学菌体的生物量与时间的关系是菌体的生物量与时间的关系是S形曲线形曲线生生物物量量X延延滞滞期期 对对数数生生长长期期减减速速期期静静止止期期衰衰亡亡期期培养时间培养时间 t延滞期：基本无生长。延滞期：基本无生长。指数期指数期/对数生长期：对数生长期：减速期：减速期：静止期静止期/稳定期：稳定期：分为五个阶段分为五个阶段25营养物质的耗尽。营养物质的耗尽。营养物比例失调。营养物比例失调。有害代谢产物的积累。有害代谢产物的积累。pH、氧化还原势等条件越来越不适宜。氧化还原势等条件越来越不适宜。1.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力学稳定期到来的原因稳定期到来的原因*静止期往往是目标产物生成的主要阶段，为静止期往往是目标产物生成的主要阶段，为了延长静止期，常在此阶段进行补料操作。了延长静止期，常在此阶段进行补料操作。261.3 1.3 微生物生长动力学微生物生长动力