川芎嗪注射液对博莱霉素致肺纤维化大鼠转化生长因子干预作用的研【摘要】目的研究川芎嗪注射液对肺纤维化大鼠转化生长因子1TGF-1的干预作用。方法气管内注入博莱霉素A5复制肺纤维化动物模型，造模第2天川芎嗪大、中、小剂量组每日开场腹腔注射川芎嗪注射液至28天，剂量分别为250，150，40g/kgd。应用放免及免疫组织化学方法，检测第14，28天时血清TGF-1及第28天时肺组织中以上指标的表达。结果川芎嗪注射液能降低肺纤维化大鼠血清及肺组织TGF-1的表达，降低肺纤维化增生程度，其中以川芎嗪大剂量组效果最为明显。结论降低肺纤维化大鼠TGF-1的表达，可能是川芎嗪注射液发挥治疗作用的机理之一。【关键词】川芎嗪注射液肺纤维化转化生长因子肺纤维化是以慢性进展性弥漫性肺间质纤维化和肺生理功能障碍为特点的肺间质性疾病,其主要病理特点是：早期弥漫性肺泡炎,后期大量成纤维细胞病理性增生及基质胶原进展性积聚,并取代正常的肺组织构造。对于本病目前尚缺乏有效的治疗方法,为进一步分析其分子作用机制,我们采用博莱霉素复制肺纤维化动物模型,通过放免及免疫组织化学方法,观察本模型中血清及肺组织转化生长因子TGF-1的变化,讨论川芎嗪注射液对以上指标的影响。1器材1.1动物70只清洁级istar雄性大鼠体重150170g,由河北医科大学实验动物中心提供，答应证号：SXK(冀)2022-1-003，合格证编号：DK0509103。1.2药品博莱霉素A5(BL)由天津太河制药消费；川芎嗪注射液(40g/2l,国药准字H11020960，批号:05060601)由北京市永康药业消费。1.3试剂与仪器放免试剂盒购于上海市军医学研究所；放射免疫计数器为中国科技大学实业总公司产品;TGF-1多克隆抗体购自美国Santaruz公司;SP试剂盒购自美国Zyed公司。HPLAS-1000高明晰度彩色病理报告分析仪、计算机图像处理系统及相应软件购自德国pten公司。2方法2.1模型分组、复制及标本留取70只雄性大鼠除12只作为空白组外,其余58只乙醚麻醉后,经颈正中切口别离气管,按5gkg-1用生理盐水稀释为5gl-1气管内注入博莱霉素A5后,立即将动物直立并旋转,使药液在肺内分布均匀。注入药物过程中,由于操作失误导致大出血等原因死亡4只,其余54只随机分为4组：模型组14只、川芎嗪大剂量组简称“大剂量组14只、川芎嗪中剂量组简称“中剂量组13只、川芎嗪小剂量组简称“小剂量组13只。造模第2天大剂量组、中剂量组、小剂量组开场每日腹腔注射川芎嗪注射液,剂量分别为250，150，40g/kgd。模型组腹腔注射中剂量组等容积生理盐水；空白组12只大鼠别离气管后,气管内按1l/kg注射生理盐水,并于造模第2天开场每天腹腔注射中剂量组等容积生理盐水。实验第14天时每组随机取10只大鼠,股静脉采血离心,取血清,-20冰箱保存备用。至实验末即第28天时将大鼠麻醉后留取：血清：股静脉采血,取血清。肺组织标本：肺左下叶置于4%甲醛固定液中保存,常规石蜡包埋、切片(4),进展免疫组织化学鉴定。2.2血清学指标测定方法采用放免法测定第14及28天血清中TGF-1的表达。2.3肺组织指标测定方法2.3.1免疫组织化学检测用SP法测定TGF-1的表达,一抗为兔抗大鼠TGF-1,按1100稀释,以磷酸盐缓冲液替代一抗作为阴性对照,正常山羊血清封闭,滴加生物素标记的第二抗体,DAB显色,苏木素复染,常规脱水、透明、封片。2.3.2免疫组织化学染色半定量分析空白组取6只大鼠标本,其余各组每组选取7只大鼠标本,每个标本随机观察一张切片,每张切片随机选取上、中、下、左、右5个视野,摄像并存入计算机,采用HIAS-2000型高明晰度彩色病理图象分析系统。用阳性染色面积和每个视野面积的百分比表示该成分的相对含量。2.4统计学方法采用SPSS11.5frinds统计软件,所有数据均采用s表示,采用单因素方差分析法对实验结果进展统计学分析。3结果3.1大鼠死亡情况至实验末模型组、大剂量组各死亡2只,中剂量组、小剂量组各死亡1只,其原因可能与博莱霉素A5的毒副作用及气管切口处感染有关。3.2大鼠体重变化情况结果说明,第1天时各组之间无明显差异P0.05；第14天时,模型组明显低于空白组P0.01；川芎嗪大、中、小剂量组明显高于模型组P0.01；川芎嗪大、中、小剂量组之间无明显差异P0.05；第28天时,模型组明显低于空白组P0.01；川芎嗪大、小剂量组明显高于模型组P0.01；P0.05,川芎嗪中剂量组与模型组无明显差异P0.05。川芎嗪大剂量组高于中、小剂量组P0.05。提示随着肺纤维化病程延长，川芎嗪大剂量组体重增长较明显，具有一定优势。结果见表1。表1第1，14，28天时各组大鼠体重变化情况比拟略3.3血清中TGF-1含量的测定与空白组比拟,模型组第14天、28天时血清中TGF-1含量均明显升高P0.01；川芎嗪大、中、小剂量组与模型组比拟其含量明显降低P0.05或P0.01。第14天时大剂量组TGF-1含量与中剂量组比拟无明显差异P0.05,与小剂量组比拟明显降低P0.01；第28天时大剂量组TGF-1含量明显低于中、小剂量组P0.05；P0.01；提示大剂量组明显优于中、小剂量组。结果见表2。表2第14，28天血清中TGF-1含量的测定略3.4各组大鼠第28天时肺组织TGF-1蛋白表达、分布及半定量分析空白组在少数细支气管黏膜上皮细胞的胞浆中TGF-1有比拟弱表达;模型组在支气管黏膜上皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞中均有高表达。川芎嗪大、中、小剂量组在支气管黏膜上皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞中均有比拟弱的表达,其中川芎嗪大剂量组表达更弱。半定量分析结果说明，与空白组比拟,模型组肺组织中TGF-1相对含量均明显升高P0.01；川芎嗪大、中剂量组与模型组比拟其含量明显降低P0.01或P0.05；小剂量组与模型组比拟无明显差异P0.05；大、中、小剂量组之间无明显差异P0.05。但大剂量组相对含量的数值低于中、小剂量组。提示大剂量组有一定优势。结果见表3。表3第28天肺组织TGF-1相对含量的比拟略4讨论肺纤维化是由多种原因引起的一类间质性疾玻肺组织的细胞外基质与肺纤维化关系最为亲密1。细胞外基质成分在一定条件下的过度沉积,最终形成肺纤维化。TGF-1是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂,它能作用于多个环节,刺激各种细胞外基质成分的合成和沉积,包括上调基质成分的转录、翻译和翻译后步骤,促进基质蛋白和受体的产生,减少基质降解酶以及增加降解抑制剂的合成,导致纤维化的形成。川芎嗪是由伞形科藁本属植物川芎中别离提纯出的生物碱单体,是传统的活血化淤药物。近年来研究发现川芎嗪可以改善微循环,对抗脂质过氧化反响,减轻纤维化发病过程中的脂质过氧化连锁反响2,抑制成纤维细胞增生以及、型胶原基因转录,对肺纤维化有一定治疗作用3。故本实验采用博莱霉素复制肺纤维化动物模型,通过放免及免疫组织化学方法,观察本模型中血清及肺组织TGF-1的变化。实验结果说明,在应用博莱霉素A5后血清及肺组织中TGF-1的表达升高,肺纤维化形成,而川芎嗪注射液能降低肺纤维化大鼠血清及肺组织TGF-1的表达,降低肺纤维化增生程度,其中以川芎嗪大剂量组效果最为明显。提示应用川芎嗪常规剂量治疗肺纤维化难以发挥较好的疗效，大剂量治疗肺纤维化具有一定优势。本研究提示川芎嗪注射液能降低肺纤维化大鼠TGF-1的含量,从而阻断该细胞因子的致纤维化效应,延缓肺纤维化的进程,其详细作用机制有待于进一步研究。【参考文献】1kDN,BrassD,ShartzDA,etal.AatrixfrneideasinpulnaryfibrsisJ.AJRespirelllBil,2002,27:122.2边晓丽,陈学敏,刘艳霞,等.川芎嗪及其衍生物对羟自由基的去除作用J.中国医院药学杂志,2022,23(11):678.3史大卓.川芎嗪的药理作用诌议J.中国中西医结合杂志,2022,23(5):377.