F90对胶质母细胞瘤细胞的作用及机制研究【摘要】目的讨论表皮生长因子受体egfr抑制剂f90对胶质母细胞瘤gb细胞的抑制作用及其机制。方法采用tt法检测f90对gb细胞的抑制作用，流式细胞术检测细胞凋亡和免疫印迹法esternblt检测蛋白表达。结果f90能明显抑制u251和shg-44细胞的生长，半数抑制浓度i50分别为5.81.3和5.11.2l/l，且呈一定的剂量相关性。f90可以诱导u251细胞的凋亡，抑制u251细胞egfr的磷酸化及其丝裂原活化的蛋白激酶apk通路下游信号的活化，下调bl-2蛋白的表达，上调p53蛋白的表达。结论f90能有效抑制某些gb细胞在体外的生长，与iressa作用强度相当，有可能成为一种新的治疗gb的药物。【关键词】胶质母细胞瘤受体表皮生长因子effetandantiturehanisff90ngliblastaellsliufangjun1,guisngbai2,sunzelin1,etal.1.beijingneursurgialinstitute,beijing100050,hina;2.departentfneursurgery,beijingtiantanhspital,apitaluniversityfedialsienes,beijing100050,hinaabstrat:bjetivetinvestigatetheantitureffetsandantiturehanisff90,akindfinhibitrfepideralgrthfatrreeptr(egfr)ngliblasta(gb)ells.ethdsantiturativityff90asdetetedbyttassay.theantiturehanisasinvestigatedbyflytetryandesternbltassay.resultsu251andshg-44ellsereinhibitedbyf90inadse-dependentannerinvitr.the50%inhibitrynentratin(i50)ftheas5.81.3and5.11.2l/l,respetively.f90inhibitedphsphrylatinfegfranddnstreasignalingprteinsfitgen-ativatedprteinkinase(apk)pathay,up-regulatedp53prteinanddn-regulatedbl-2prtein,induedellapptsisnfiredbyflytetry.nlusinf90iseffetivefrgrthinhibitinfsegbellsinvitrandhasasiilareffettiressa,therefreaybeanvelptentagentfrgb.keyrds:gliblasta;reeptr,epideralgrthfatr;在高度恶性的胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤gb中经常能见到表皮生长因子受体egfr的过表达1。由英国阿斯利康研发的iressagefitinib，zd1839是一种选择性的egfr酪氨酸激酶抑制剂，在体外对高表达egfr或转染egfr基因的gb有抑制生长及抗侵袭作用2。f90是中国医学科学院药物研究所自主研制开发的一种iressa前药，在体外经脂酶孵育或体内经胃酸作用后可以转化为有活性的iressa，已经申请了中国专利与国际专利。本实验旨在观察f90对gb细胞的抑制作用及其机制。1对象与方法1.1药品与试剂f90由中国医学科学院药物研究所化学合成室提供，经脂酶孵育24h后用于体外实验，对照药物iressa购自英国阿斯利康公司。两种药物均采用二甲基亚砜ds配制，对照组参加一样剂量的ds浓度不超过0.1%。一抗购自美国santaruz公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国prega公司。1.2细胞株人gb细胞株shg-44、tj899和tj905由中国医学科学院药物研究所药理室惠赠，bt325和u251由北京市神经外科研究所细胞室提供。均采用含10%胎牛血清fbs、100u/l青霉素和100g/l链霉素的de培养基，0.25%胰酶-乙二胺四乙酸edta消化，在含5%2的37培养箱中培养传代。1.3tt法测定肿瘤细胞存活率按1000个细胞/孔接种于96孔板，次日加含不同浓度药物及相应溶剂对照的新颖培养基，每组设3个平行孔，培养96h后，每孔加用无血清培养基新颖配制的5g/ltt100l，继续培养4h，然后每孔加200lds溶解甲臜颗粒，振荡混匀后，k3型酶标仪labsystes，dragn，finland测定光密度值d，参考波长450n，检测波长570n；抑制率%=给药组d值-对照组d值/对照组d值100%。半数抑制浓度i50由线性方程计算，通过药物浓度对生长抑制率的回归曲线进展推算。1.4流式细胞术检测细胞凋亡不同浓度化合物iressa5l/l，f902.5、5和10l/l作用u251细胞48h后，搜集贴壁细胞，用预冷pbs洗2次，按1150比例将annexinv-异硫氰荧光素fit、碘化丙啶pi和4-羟乙基哌氰乙磺酸hepes缓冲液配成annexinv-fit/pi染液。每100l染液重悬1105个细胞，室温下孵育15in后参加1lhepes缓冲液混匀上机。以激发波长488n，发射波长525、575n分别检测fit和pi荧光。每样本搜集10000个细胞荧光信号。1.5esternblt杂交分析蛋白表达将不同浓度化合物iressa5l/l，f902.5，5和10l/l作用u251细胞48h后，搜集贴壁的细胞，从3106个细胞中提取蛋白质，裂解液裂解细胞。采用bradfrd法计算蛋白质含量，然后用细胞裂解液将各样品调至一样浓度，取各组蛋白质样品120g，上样30l，经8%和10%十二烷基硫酸钠sds-page电泳后，用半干法转膜，参加稀释的一抗，常温孵育2h或4过夜，洗膜3遍，参加相应的二抗，常温孵育2h或4过夜，洗膜后，用增强化学发光法elplus，aershapharaiabiteh，usa显影并采集图像。1.6统计分析所有试验均重复3遍，结果用xs表示，esternblt结果用iagej软件测条带灰度值进展半定量分析，采用spss12.0软件进展t检验，以p0.05为差异有统计学意义。2结果2.1f90对gb细胞的生长抑制作用表1tt结果显示：f90对u251、shg-44细胞有显著的生长抑制作用，i50值分别为5.81.3和5.11.2l/l；且呈剂量依赖性，在剂量为12.5l/l时能显著抑制肿瘤细胞的生长，当到达25l/l时抑制率接近100%；对tj899和tj905细胞有一定的抑制作用；对bt325细胞那么需高剂量才能呈现抑制作用。2.2f90诱导u251细胞凋亡图1不同浓度的药物作用细胞48h后，用流式细胞仪检测，annexinv-pi染色，将早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞区分。与对照组相比，随着药物剂量的增加，凋亡细胞的数目逐渐增加；与阳性药物iressa相比，f90与其效果相似，在浓度为5l/l时即能显著诱导细胞凋亡。2.3esternblt结果图2，表2由于iressa选择性作用于磷酸化的egfr，f90是iressa的前药，因此，我们主要检测u251细胞磷酸化的egfr及其丝裂原活化的蛋白激酶apk通路下游蛋白的关键蛋白。f90对磷酸化egfr、细胞外信号调节激酶1erk1、p38和-jun氨基末端激酶jnk蛋白表达有下调作用，且随着剂量的加大，抑制作用更加明显。药物下调bl-2蛋白的表达，上调p53蛋白的表达，且与剂量有一定的相关性。同剂量的f90与iressa效果相似。3讨论大约40%50%的gb高表达egfr3，这与gb病人的预后不良，短时间内复发，对化疗、放疗抵抗等有关4。因此，阻断依赖egfr的信号传导通路即可阻止肿瘤的生长，而egfr阻断剂包括单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂作为肿瘤治疗的方法已成功应用于临床5。本研究tt结果说明：f90与iressa具有相似的作用，只是对某些gb细胞的生长有较好的抑制作用，且呈一定的剂量依赖性，其原因及机制有待于进一步研究。本研究选用了对两种药物均敏感的u251细胞来讨论其作用机制。细胞凋亡是抗肿瘤作用的重要机制之一，抗凋亡蛋白bl-2和促凋亡蛋白p53在细胞凋亡的过程中起着关键的作用6。黄海燕等7曾报告过125i在体内及体外有诱导shg-44细胞凋亡的作用，主要机制可能与抑制bl-2蛋白的表达、上调p53蛋白的表达有关。本研究esternblt也显示了类似的结果，说明f90诱导细胞凋亡主要通过下调bl-2蛋白、上调p53蛋白而发挥作用。egfr重要的下游通路是apk通路，而erk、jnk和p38是这条通路的下游信号蛋白8。apk通路与胶质瘤生长及病人预后不良有着亲密的关系，与正常组织相比，瘤组织中apk的表达明显升高9。本研究结果显示：f90在体外作用于u251细胞48h后，可以抑制磷酸化egfr的表达，同时下调下游磷酸化erk1、jnk和p38蛋白的表达，说明egfr-apk信号传导通路受到了抑制。这种下调可能是f90体外抑制u251细胞生长的主要原因。因此，我们推断：f90抑制u251细胞生长的机制可能是通过直接阻止egfr的磷酸化，从而阻断了apk下游通路的信号传导。总之，本研究结果说明：f90有希望成为用于治疗高表达egfr的gb病人的新药。【参考文献】1layfieldlj,illre,tripps,etal.epideralgrthfatrreeptrgeneaplifiatinandprteinex-pressiningliblastaultifre:prgnstisignifianeandrelatinshipttherprgnstifatrsj.appliu-nhisthelrphl,2022,14(1):91-96.2raizerjj.her1/egfrtyrsinekinaseinhibitrsfrthetreatentfgliblastaultifrej.jneurnl,2022,74(1):77-86.3shinjian,tadak,shiraishis,etal.prgnstivaluefepideralgrthfatrreeptrinpatientsithgliblastaultifrej.anerres,2022,63(20):6962-6970.4quaranta,divellar,danielea,etal.epi-deralgrthfatrreeptrserulevelsandprgnstivalueinalignantgliasj.turi,2022,93(3):275-280.5halatshe,shidtu,behnke-urshj,etal.epideralgrthfatrreeptrinhibitinfrthetreat-entfgliblastaultifreandtheralignantbraintuursj.anertreatrev,2022,32(2):74-89.6usj,nglt.apkinhibitrsandpifithrin-alphablkinnaaldehyde-induedapptsisinhuanpl/prf/5e