低温产甲烷菌分离鉴定及发酵产气初步研究目录研究背景、内容、意义研究背景、内容、意义实验部分实验部分结论及展望结论及展望致谢致谢4123研究背景&化石能源是不可再生能源，终有一天会枯竭；未来生物质能等新能源的发展将举足轻重。&沼气是一种可再生能源，对于自然条件差，生态环境脆弱的新疆农村牧区，减缓传统用能方式产生的植被破坏将具有重要意义。&新疆位于我国西北严寒地区，冬季气温、地温低，达不到最佳厌氧发酵温度；研究表明沼气产量下降，是由于中温厌氧发酵菌群进入冬季后，受低温影响活力下降和大量菌株衰亡。&因此，沼气能源在新疆的推广，受制于低温厌氧发酵。产甲烷菌为厌氧发酵菌群代谢途径中关键，低温下产甲烷菌活力下降使得整个代谢途径都会受到抑制。&本课题选择筛选耐低温产甲烷菌做为解决低温厌氧发酵途径大分子有机物糖、蛋白、脂肪水解VFA、氨基酸、单糖、H2、CO2酸化短链脂肪酸等乙酸氧化、糖酵解、脱氨基 异型乙酸发酵同型乙酸发酵氧化脱羧甲烷累积的H2、CO2CO2还原研究内容低温厌氧富集培养产甲烷菌不同低温生境采集样品厌氧滚管分离纯化鉴定（丰富生长）纯产甲烷菌株形态学、生物特性研究分子生物学鉴定耐低温兼性常温筛选耐低温产甲烷菌株驯化模拟厌氧发酵菌株厌氧发酵效果评价本课题研究出发点是，厌氧发酵关键微生物产甲烷菌；从不同生境筛选获得常温发酵且兼性耐低温产甲烷菌株，改善低温发酵沼气池厌氧菌群，提高耐低温产气能力。目录研究背景、内容、意义研究背景、内容、意义实验部分实验部分结论及展望结论及展望致谢致谢4123实验部分低温产甲烷菌的筛选分离及生物学特性研究1低温产甲烷菌的保藏23菌株的分子生物学鉴定4菌株发酵产气的初步研究5产甲烷菌富集培养筛选纯化从越冬沼气池和湖底采集污泥样品富集产甲烷菌耐低温产甲烷菌株筛选菌株形态学观察荧光相差显微镜下：观察发绿色荧光 菌株呈叠形不规则球状不规则裂殖细胞不运动SZ-2菌株生物学特性菌株可用碳源底物、抗生素敏感性性&SZ-2菌株可利用碳源底物：H2/CO2混合物、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺作为单一碳源底物产生甲烷；不能在以甲酸盐、乙酸盐、丙醇、丁醇作为唯一碳源的培养基上生长代谢产生甲烷。小结厌氧分离获得两株产甲烷菌SZ-1、SZ-2经过筛选，SZ-2菌株符合兼性耐低温且常温也能良好产气要求 SZ-2呈八叠球状，1530 产气良好，TOPT=25 ；最适pH值6；最适氯化钠浓度0.2 mol/L；H2/CO2、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺为其可利用单一碳源底物。SZ-2菌株不能耐受链霉素和卡那霉素 实验部分低温产甲烷菌筛选分离及生物学特性研究1菌株分子生物学鉴定2低温产甲烷菌保藏3菌株发酵产气初步研究4低温产甲烷菌的保藏实验部分低温产甲烷菌的筛选分离及生物学特性研究1菌株分子生物学鉴定2低温产甲烷菌保藏3菌株发酵产气初步研究4SZ-2菌株DNA提取、16S rDNA 扩增克隆酶切和质粒PCR验证 引物：5，-C/TTAAGCCATGCG/AAGT-3，5-T/CGGGTCTCGCTCGTT G/ACC-3，菌株测序结果及系统发育分析菌株测序结果及系统发育分析小结菌株SZ-2同源比对和系统发育分析属于产甲烷八叠球菌属菌株（Methanosarcina），并与巴氏甲烷八碟球菌属菌株亲缘关系较近 结合菌株的生理生化和形态学特征分析，菌株SZ-2与巴氏甲烷八叠球菌基本相符，只有最适温度有差异可能是长期生长在寒冷低温沼气池中适应低温环境驯化的结果 实验部分低温产甲烷菌筛选分离及生物学特性研究1低温产甲烷菌的保藏2菌株分子生物学鉴定3菌株发酵产气初步研究4排水集气甲烷产量测定：气体体积与气相色谱测定甲烷浓度的乘积SZ-2菌株驯化 1-2 d，甲烷产量少，共生菌受到刺激生长繁殖 3-5 d，互营共生发酵开始启动6 d，SZ-2开始成为优势菌株 6-11 d，SZ-2菌株复合菌群大量繁殖结论：6-11 d，经驯化后SZ-2菌株发酵污泥菌群具备良好耐低温发酵高效产气的能力；接种于低温沼气发酵瓶中将有利于改善沼气发酵。厌氧发酵对比实验一组：牛粪和秸秆混合物未添加外来菌剂进行厌氧发酵，原始菌群不能适应低温15环境 二组：SZ-2菌株扩大后发酵牛粪和秸秆混合物，SZ-2菌株需要对发酵环境适应、互营共生关系的建立等，发酵启动时间等受影响三组：驯化后 SZ-2菌株复合污泥菌群，菌群互营共生关系良好；对低温发酵环境适应能力强；因此从发酵启动时间和产量上都优于前两组。小结耐低温SZ-2菌株能够适应低温发酵环境并与菌群建立共生关系，低温发酵的启动时间和发酵产气量增长明显驯化后的含有SZ-2菌株的菌群能更好适应低温发酵，发酵启动时间和产气量提高效果更好。目录研究背景、内容、意义研究背景、内容、意义实验部分实验部分结论及展望结论及展望致谢致谢4123结论(1)厌氧条件下从沼气池和湖底采集污泥中分离两株产甲烷菌菌株，SZ-1、SZ-2；SZ-2菌株符合兼性耐低温且常温也能良好产气要求；SZ-2菌株呈明显八叠球状，1530产气良好，25为最适温度，最适pH值为6，氯化钠耐受范围为00.4 mol/L,0.2 mol/L时最适宜；可利H2/CO2、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺作为单一碳源底物；不能耐受链霉素和卡那霉素。(2)对菌株进行短期保藏时，温度控制在低温零度且添加足够营养厌氧保存最长时间2个月后菌种复活仍有活力。SZ-2菌株长期保藏，采用改进厌氧甘油低温冷冻保藏法，SZ-2菌株保藏68月时就应进行传代。(3)SZ-2菌株测序；经过同源比对和系统发育分析确定属于产甲烷八叠球菌属菌株（Methanosarcina），并与巴氏甲烷八碟球菌属菌株亲缘关系较近。结合菌株形态学、结构特征、生理生化特性，SZ-2菌株为一株耐低温驯化后的兼性嗜冷巴氏甲烷八叠球菌。(4)SZ-2菌株扩大培养后投入到模拟发酵瓶装置中，低温15厌氧发酵秸秆和牛粪混合物；耐低温SZ-2菌株能够适应低温发酵环境并与菌群建立共生关系，低温发酵的启动时间和发酵产气量增长明显；驯化后的含有SZ-2菌株的污泥菌群能更好适应低温厌氧发酵环境，发酵启动时间和产气量改善效果更好。工作不足及展望&(1)筛选获得耐低温产甲烷菌种资源还不足，自然界其它环境中还存在很多优质耐低温产甲烷菌，可通过已经掌握的厌氧分离技术筛选获得更多。&(2)厌氧菌种保藏方法还需要进行改进，一种好的厌氧微生物菌种保藏方法应能够延长菌种保藏时间，提高菌种复活成活率。以后工作可通过对已有方法改进或借鉴其他技术提高厌氧条件下产甲烷菌菌株保藏时间。&(3)对于菌株发酵产气研究不能停留在提高产气量的研究，厌氧发酵是微生物菌群协同作用的过程，当目的菌株投入到发酵液中，菌株本身是否真的富集生长成为优势产甲烷菌，需要对菌群做PCR-DGGE、荧光原位杂交等分析，从分子生物学角度研究解释低温厌氧发酵需解决的问题。目录研究背景、内容、意义研究背景、内容、意义实验部分实验部分结论及展望结论及展望致谢致谢4123致谢l本论文是在导师鲁建江副教授的悉心指导下完成，三年来导师严谨求实的治学态度，锐意创新的学术作风，认真负责、公而忘私的敬业精神，豁达开朗的宽广胸怀，平易近人、诲人不倦的高尚师德，使我受益匪浅；在我的学习和实验过程中，导师都给予了我极大的关心和帮助，使我在三年的学习当中收获丰厚。l同时，我还要忠心感谢化学化工学院同学和生化课题组老师对我论文的帮助，和阿拉山口检疫局技术中心实验室无私提供给我的实验条件使我的论文得以顺利进行，在此一并感谢。l最后，我还要感谢关爱我的亲人们和我的父母，他们所给予我无私帮助和关爱，是支持我研究生学习的坚强后盾，使我的学业得以顺利的完成。论文发表情况l一一株低温产甲烷菌的筛选分离与系统发育分析研究，已被石河子大学学报收稿录用。The End