分子标记及其在植物遗传育种中的应用遗传标记遗传标记（genetic markergenetic marker）具有多型性具有多型性易于鉴别易于鉴别与目标基因紧密连锁与目标基因紧密连锁 性状标记性状标记 色泽，色泽，形态形态 细胞学标记细胞学标记 倒位，易位，倒位，易位，G/N/CG/N/C带带 生化标记生化标记 同功酶同功酶 分子标记分子标记 RFLP RFLP、RAPDRAPD、SSRSSR、AFLPAFLP、SNP SNP 基础基础基础基础-基因表达基因表达基因表达基因表达结果结果结果结果表现型表现型表现型表现型DNADNA碱基碱基碱基碱基序列变异序列变异序列变异序列变异形态标记形态标记n n遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征-遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。l l如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。vv特点：直观简洁特点：直观简洁特点：直观简洁特点：直观简洁l l从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。环节，表型差异有时难以反映基因型差异。环节，表型差异有时难以反映基因型差异。环节，表型差异有时难以反映基因型差异。细胞学标记细胞学标记n n染色体数目变异及结构变异，表现在染色体染色体数目变异及结构变异，表现在染色体染色体数目变异及结构变异，表现在染色体染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（和带型（和带型（和带型（C C带、带、带、带、N N带、带、带、带、GG带等）。带等）。带等）。带等）。l l随着分带、细胞原位杂交等讨论技术的进展，随着分带、细胞原位杂交等讨论技术的进展，随着分带、细胞原位杂交等讨论技术的进展，随着分带、细胞原位杂交等讨论技术的进展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。可在染色体水平揭示更多遗传变异。可在染色体水平揭示更多遗传变异。可在染色体水平揭示更多遗传变异。vv特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相像时难以分辨。当染色体数目形态相像时难以分辨。当染色体数目形态相像时难以分辨。当染色体数目形态相像时难以分辨。生化标记生化标记贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白和同工酶n n贮藏蛋白贮藏蛋白 同工酶同工酶vv特点：经济、便利、成本较低特点：经济、便利、成本较低vv结构基因表达产物，对非结构基因无能结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。数量有限，有时受发育时期和环境影响。分子标记本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1 1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；）不受季节、环境、基因表达与否的限制；）不受季节、环境、基因表达与否的限制；）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2 2）多态性高，存在着丰富的等位变异；）多态性高，存在着丰富的等位变异；）多态性高，存在着丰富的等位变异；）多态性高，存在着丰富的等位变异；（3 3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；）数量丰富，多态性遍及整个基因组；）数量丰富，多态性遍及整个基因组；）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（4 4）表表表表现现现现为为为为“中中中中性性性性”，不不不不影影影影响响响响目目目目标标标标性性性性状状状状的的的的表表表表达达达达，与不良性状无必定的连锁；与不良性状无必定的连锁；与不良性状无必定的连锁；与不良性状无必定的连锁；（5 5）很多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂）很多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂）很多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂）很多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，供应完整的信息。合基因型，供应完整的信息。合基因型，供应完整的信息。合基因型，供应完整的信息。分子标记的分类（分子标记的分类（Staub等等1996）分分子子标标记记以以Southern为基础如为基础如RFLP以以PCR为基础为基础单引物单引物PCR标记标记 有有RAPD、AP-PCR、DAF、ISSR等等双引物选择性扩增双引物选择性扩增PCR 主要指主要指AFLP需克隆、测序构建特殊双引物需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记标记如如SSR、STS等等植物遗传讨论中常用的分子标记n nRFLPRestrictionFragmentLengthRFLPRestrictionFragmentLengthPolymorphismPolymorphismn nRAPDRandomAmplifiedPolymorphicRAPDRandomAmplifiedPolymorphicDNAsDNAs(DAF,AP-PCR)(DAF,AP-PCR)n nSSRSimpleSequenceRepeatSSRSimpleSequenceRepeatn nAFLPAmplifiedFragmentLengthAFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphismPolymorphismRFLPn n原理：原理：原理：原理：DNADNA限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切电泳电泳电泳电泳转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小n n酶切：酶切：酶切：酶切：3-5ugDNA3-5ugDNA，以以以以1010U U内切酶酶切内切酶酶切内切酶酶切内切酶酶切5 5小时小时小时小时 n n电泳：电泳：电泳：电泳：0.6-0.8%0.6-0.8%琼脂糖胶琼脂糖胶琼脂糖胶琼脂糖胶7070V V电泳电泳电泳电泳1616小时小时小时小时 n n染色：染色：染色：染色：EtBrEtBr染色染色染色染色2020分钟分钟分钟分钟 n n变性：变性：变性：变性：0.250.25MHCl20MHCl20分钟，抽真空，水冼分钟，抽真空，水冼分钟，抽真空，水冼分钟，抽真空，水冼n n印迹：加入印迹：加入印迹：加入印迹：加入0.4NNaOH0.4NNaOH，进行进行进行进行SouthernSouthern印迹印迹印迹印迹n n冲洗：以冲洗：以冲洗：以冲洗：以2 2SSCSSC冼胶，风干冼胶，风干冼胶，风干冼胶，风干酶切酶切电泳电泳印迹印迹杂交洗脱n n预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、55HSBHSB、DenhardtDenhardt）中，中，中，中，封好后置封好后置封好后置封好后置6565温温温温箱中振荡箱中振荡箱中振荡箱中振荡5 56 6小时。小时。小时。小时。n n杂交：预杂交液中加入标记好的杂交：预杂交液中加入标记好的杂交：预杂交液中加入标记好的杂交：预杂交液中加入标记好的markermarker和和和和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置6565温箱中振荡过夜。温箱中振荡过夜。温箱中振荡过夜。温箱中振荡过夜。n n洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液6565 振荡洗脱两次（振荡洗脱两次（振荡洗脱两次（振荡洗脱两次（1515min/min/次）次）次）次），吸干包好。吸干包好。吸干包好。吸干包好。放射自显影将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上,于暗室于暗室于暗室于暗室中将中将中将中将 X-X-光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上，再放上另一再放上另一再放上另一再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置-70-70超低温冰箱中曝光超低温冰箱中曝光超低温冰箱中曝光超低温冰箱中曝光1010天左右。天左右。天左右。天左右。使用磷屏仪，操作更便利。使用磷屏仪，操作更便利。使用磷屏仪，操作更便利。使用磷屏仪，操作更便利。RFLP探针n n来源：来源：来源：来源：cDNAcDNAcDNAcDNA探针与基因组探针与基因组探针与基因组探针与基因组DNADNADNADNA（gDNAgDNAgDNAgDNA）探针探针探针探针n ncDNAcDNAcDNAcDNA探探探探针针针针:保保保保守守守守性性性性较较较较强强强强，探探探探针针针针检检检检测测测测的的的的多多多多态态态态性性性性频频频频率率率率较低。较低。较低。较低。n ngDNAgDNAgDNAgDNA探探探探针针针针:检检检检测测测测的的的的多多多多态态态态性性性性频频频频率率率率较较较较高高高高，但但但但不不不不同同同同种种种种属属属属特异性较强。特异性较强。特异性较强。特异性较强。n n玉米玉米玉米玉米RFLPRFLPRFLPRFLP探针：探针：探针：探针：http:/www.maizegdb.org/probes.Htmlhttp:/www.maizegdb.org/probes.Html探针标记随机引物法n n2525ngng变性变性变性变性DNADNAn n5 5ulul寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸n n2ulBSA2ulBSAn n3ul-3ul-3232PdCTPPdCTPn n2 2ulKlenowulKlenow酶酶酶酶n n加水至加水至加水至加水至5050ulul，3737温箱中标记温箱中标记温箱中标记温箱中标记2 2小时小时小时小时RFLP标记标记特点特点l共显性，可以区分纯合和杂合基因型共显性，可以区分纯合和杂合基因型l稳定、重复性强稳定、重复性强l某些植物中开发探针已遍及整个基因组某些植物中开发探针已遍及整个基因组l缺点：缺点：DNADNA需要量较大，技术简洁；需要量较大，技术简洁；用于做图较费时，难以分析大量样品用于做图较费时，难以分析大量样品；在基因组较大、严格自花授粉作物上多在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低。态性很低，使遗传图饱和度低。RAPDn n原理：原理：用一个随机引物（用一个随机引物（8-10bp）、）、碱基随碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组增基因组DNA，然后电泳分开扩增片然后电泳分开扩增片段。段。Polymerase Chain Reaction-PCR3553Target DNA sequenceGCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGde