希普：首例胚胎移植成功哈里森:首创动物组织体外培养法张明觉：发现哺乳动物精子哺乳动物精子获能现象获能现象格登、童第周：体细胞核移植成功试管家兔试管家兔诞生米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术胚胎分割移植胚胎分割移植成功埃文斯：成功分离和培养分离和培养小鼠的胚胎干细胞胚胎干细胞克隆羊多莉克隆羊多莉诞生山中伸弥：获得诱导多能干细胞诱导多能干细胞单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿试管婴儿诞生我国科学家首次培育了体体细胞克隆猴细胞克隆猴。1890年1907年1951年1958年1959年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年动物物细胞工程的胞工程的发展展历程程科技探索之路第第2节节 动物细胞培养动物细胞培养第2章 细胞工程动物细胞工程常用的技术：动物细胞工程常用的技术：l动物细胞动物细胞培养培养l动物细胞动物细胞融合融合l动物细胞动物细胞核移植核移植等等动动物物细细胞工程的基胞工程的基础础从社会中来 在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤养出可供移植的皮肤？通过细胞培养构建的人造皮肤通过细胞培养构建的人造皮肤 可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；体外进行培养、扩增；目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；以获得适合临床上使用的人造皮肤；一 动物细胞培养0102动物细胞培养的条件03干细胞培养及其应用动物细胞培养的过程1.1.概念概念 从动物体中从动物体中_相关的相关的_，将它，将它_，然后在，然后在_下，让这些细胞下，让这些细胞_和和_的技术；的技术；2.2.原理：原理：_ 取出取出组织组织分散成单个细胞分散成单个细胞适宜的培养条件适宜的培养条件生长生长增殖增殖细胞增殖（有丝分裂）细胞增殖（有丝分裂）动物细胞培养动物细胞培养将细胞将细胞所需的营养物所需的营养物质质按种类和所需量严按种类和所需量严格配格配制而制而成的培养基成的培养基含人类未知、细胞生长增含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，殖所必需的物质，满足细满足细胞对未知营养成分的需求胞对未知营养成分的需求。（1）培养基的构成：培养基的构成：合成培养基合成培养基+血清等血清等天然成分天然成分一般使用一般使用液体培养基液体培养基，也称，也称为培养液培养液 01动物细胞培养的条件2.培养条件：培养条件：（2 2）培养基的物理性质培养基的物理性质适宜的温度：哺乳动物细胞多以适宜的温度：哺乳动物细胞多以_为宜；为宜；适宜的适宜的pHpH：多数动物细胞的适宜多数动物细胞的适宜pHpH为为_ _；适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。培养液、培养用具：灭菌处理；培养液、培养用具：灭菌处理；无菌操作；无菌操作；定期更换培养液定期更换培养液，以便以便清除代谢物清除代谢物。01动物细胞培养的条件36.536.50.50.57.2-7.47.2-7.4思考？如何防止培养过程中的微生物污染？如何防止培养过程中的微生物污染？适量添加抗生素适量添加抗生素维持培养液的维持培养液的pH95%空气空气+5%CO2 的的CO2 培养箱培养箱COCO2 2培养箱培养箱 01动物细胞培养的条件2.培养条件：培养条件：O2：细胞有氧呼吸胞有氧呼吸所必需所必需动物细胞培养所需气体主要有动物细胞培养所需气体主要有_和和_O O2 2COCO2 2取动物组织取动物组织（动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物）用机械的方法，或用胰蛋用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理白酶、胶原蛋白酶处理单个细胞单个细胞加培养液加培养液细胞悬液细胞悬液原代培养原代培养（1010代以内）代以内）在培养皿或在培养皿或培养瓶中培养瓶中传代培养传代培养（1010代以后）代以后）二、二、动物物细胞培养的胞培养的过程程分瓶分瓶细胞工程111102动物细胞培养的过程原代培养：指动物组织经处理后的初次培养,分瓶前的细胞培养。传代培养：分瓶后的细胞培养。悬浮浮细胞胞贴壁壁细胞胞制成细胞悬液，分瓶培养收集细胞加培养液加培养液离心法离心法胰蛋白胰蛋白酶，离心法离心法1.1.需分瓶进行传代培养的原因：需分瓶进行传代培养的原因：取动物组织取动物组织（动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物）用机械的方法，或用胰蛋用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理白酶、胶原蛋白酶处理单个细胞单个细胞加培养液加培养液细胞悬液细胞悬液原代培养原代培养（1010代以内）代以内）传代培养传代培养（1010代以后）代以后）分瓶分瓶分裂受阻。悬浮细胞：细胞密度过大、分裂受阻。悬浮细胞：细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质等；有害代谢物积累和培养液中营养物质等；贴壁细胞：除上述因素影响外，还会发贴壁细胞：除上述因素影响外，还会发生接触抑制现象。生接触抑制现象。2.2.分瓶培养的步骤：分瓶培养的步骤：细胞工程121202动物细胞培养的过程1 1）选幼龄动物（或胚胎）的组织）选幼龄动物（或胚胎）的组织这些个体的细胞分化程度这些个体的细胞分化程度低、增殖能力强，易培养。低、增殖能力强，易培养。3 3）分散细胞分散细胞时为何不选用时为何不选用胃蛋白酶胃蛋白酶？2 2）培养前为什么分散成单个细胞？培养前为什么分散成单个细胞？分散不会限制彼此的生长与增殖；分散不会限制彼此的生长与增殖；分散有利于与培养液充分接触，保分散有利于与培养液充分接触，保证证O O2 2与营养供应和代谢物及时排出。与营养供应和代谢物及时排出。多数动物细胞生存的适宜多数动物细胞生存的适宜pHpH为为7.27.27.47.4，而胃蛋白酶的适宜，而胃蛋白酶的适宜pHpH约为约为2 2，在此环境中会失活。，在此环境中会失活。思考？4.4.离心的作用？离心的作用？5.5.动物细胞培养技术有没有体现动物细胞的全能性动物细胞培养技术有没有体现动物细胞的全能性？在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶未体现；动物细胞培养只是细胞增殖的过程未体现；动物细胞培养只是细胞增殖的过程思考？6.“6.“细胞增殖到互相接触的时候，细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白糖蛋白识别了识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因抑制现象，并阐述原因癌细胞；癌细胞；癌癌细胞的胞的细胞膜上糖蛋白等物胞膜上糖蛋白等物质减少减少取动物组织用机械法或用用机械法或用胰蛋白酶胰蛋白酶、胶原蛋白酶胶原蛋白酶等处理等处理分散成单个细胞解决解决悬浮生长贴壁生长(大多数）细胞密度过大、细胞密度过大、有害代谢物积累、有害代谢物积累、营养物质缺乏等营养物质缺乏等接触抑制传代培养细胞悬液原代培养分瓶分瓶培养培养原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。时，细胞停止分裂增殖的现象。传代培养：分瓶后的细胞培养。传代培养：分瓶后的细胞培养。加培养液加培养液在培养皿或培养瓶内在培养皿或培养瓶内悬浮培养的细胞悬浮培养的细胞:直接用离心法收集直接用离心法收集贴壁细胞贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集细胞分裂受阻制成细胞悬液，分瓶培养收集细胞 相关概念细胞工程181803干细胞培养及其应用干细胞培养及其应用1.1.干细胞的概念：干细胞的概念：2 2.干细胞的来源干细胞的来源：3 3.干细胞的类型干细胞的类型：动物和人体内保留的动物和人体内保留的具有分裂和分化能力具有分裂和分化能力的细胞的细胞。在在一定的条件一定的条件下，下，干细胞可以分化成其他类型的细胞干细胞可以分化成其他类型的细胞。早期胚胎、骨髓和脐带早期胚胎、骨髓和脐带血血等等多种组织和器官中。多种组织和器官中。早期胚胎中早期胚胎中具有具有分化为分化为成年动物体内的成年动物体内的任何一任何一种类型的细胞种类型的细胞，并进一步形成机体，并进一步形成机体的所有组织和器官的所有组织和器官甚至个体的潜能甚至个体的潜能。胚胎干细胞分布分布特点特点应用实例应用实例 在体外分化成心肌细胞、在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等神经元细胞和造血干细胞等局限性局限性必须从必须从胚胎胚胎中获取中获取 ，涉及伦理问涉及伦理问题题；因而限制了在医学上的应用。；因而限制了在医学上的应用。03干细胞培养及其应用1.ES细胞细胞：成体成体组织或器官内或器官内造血干造血干细胞胞（骨髓、骨髓、外周血外周血和和脐带血脐带血中）中）神神经干干细胞胞（神经系统中）（神经系统中）精原干精原干细胞胞（睾丸中）（睾丸中）具有具有组织特异性特异性，只能分化成特定的，只能分化成特定的细胞胞或或组织，不具有不具有发育成完整个体的能力育成完整个体的能力2.成体干细胞分布分布举例举例特点特点应用实例应用实例治疗治疗神经组织损伤神经组织损伤和和神经系统神经系统退行性疾病退行性疾病（如帕金森病、阿（如帕金森病、阿尔茨海默病等）尔茨海默病等）治疗治疗白血病白血病及一些及一些恶性肿瘤放恶性肿瘤放疗或化疗后引疗或化疗后引起的起的造血系统造血系统、免疫系统功能障碍免疫系统功能障碍等疾病等疾病造血干造血干细胞胞神神经干干细胞胞治治疗细胞胞损伤造成造成的疾病的疾病 03干细胞培养及其应用诱导诱导小鼠小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞的一种细胞将将特定基因或特定蛋白导入特定基因或特定蛋白导入细胞细胞 （成纤维细胞、已分化的（成纤维细胞、已分化的T T细胞、细胞、B B细胞）细胞）诱导多能干细胞概念概念制备方法制备方法应用应用优点优点用用小分子化合物诱导小分子化合物诱导形成。形成。诱导过程诱导过程无无须须破坏胚胎破坏胚胎；iPSiPS细胞可以细胞可以来源于病人自身的体细胞来源于病人自身的体细胞，将它移植回，将它移植回病人体内后，理论上可以病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应避免免疫排斥反应。可治疗可治疗镰状细胞贫血症镰状细胞贫血症；在治疗在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病阿尔兹海默病、心血管疾病等的研究也取得新进展等的研究也取得新进展 03干细胞培养及其应用3.iPS细胞细胞：*因此，普遍认为因此，普遍认为iPSiPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞细胞的应用前景优于胚胎干细胞无菌、无毒营养温度、pH和渗透压气体环境制备细胞悬液原代培养传代培养动物细胞培养动物细胞培养的条件动物细胞培养的过程干细胞的培养和应用干细胞的种类、特点及应用iPS细胞的培养和应用1 1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。（1 1）培养环境中需要）培养环境中需要O O2 2，不需要，不需要COCO2 2 。（。（）（2 2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（）（3 3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（）（4 4）培养瓶中的细胞需