生物工程上游技术综合设计实验利用不同的方法筛选和鉴定转化子生命科学学院生物工程09级1班 同组成员： 指导教师： 摘要：通过转化子筛选、菌落直接PCR、重组质粒大小鉴定、重组质粒酶切鉴定、重组质粒的进一步PCR鉴定等一系列步骤，我组成功筛选并鉴定了含有pET32-CaM5转化子的两个菌落，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。关键词：转化子；筛选；鉴定；PCR；凝胶电泳引言：在质粒载体上进行克隆时，由于量少，连接产物没有也不可能再经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，细菌（宿主）的转化效率极低，即转化实验后绝大部分细菌（宿主）是没有被转化的，因此有必要对转化产物进行筛选和鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，从候选重组子中提取质粒。一、 使用仪器、材料1、 材料实验九装备好的转化产物：含pET32-CaM5 或pET32的E. coli DH5菌株（R，M，Amp）2、 设备用具PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、eppendorf管（1.5mL离心管）等。3、 主要试剂大肠杆菌培养试剂、质粒提取试剂、酶切试剂、PCR反应试剂、电泳试剂以及其他常规试剂。二、 实验步骤1、 转化子筛选（已做）（1） 每组连接反应转化原液取100L用无菌玻璃棒均匀涂布于筛选培养基上，37下培养半小时以上，直至液体被完全吸收。（2） 倒置平板于37继续培养1216h，平板上所长出的单菌落即为转化子。因为不带质粒的细胞无Amp抗性，不能在含有Amp的培养基时成活。2、 菌落直接PCR(1) 用无菌牙签分别挑取4个白色转化子菌落和一个已知的pET32- CaM5菌落，先在编好号的5支PCR反应管中的底部分别涂搽，然后点在新的含有Amp的筛选平板上，在其背面编号，置37过夜后保存于4。在PCR反应管中加入PCR反应混合液，进行PCR反应。(2) PCR反应混合液的配制 (50l) 10 x PCR buffer 5l dNTP mixture 4l 前向引物 (P1) 2l 反向引物 (P2) 2l rTaq酶 0.5l 灭菌蒸馏水 36.5l （注：dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM前向引物(10uM)为： 5-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3 反向引物(10uM) 为： 5-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3）所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，然后分为5份，每份10l加入上述5支PCR反应管。为了防止反应混合液蒸发，每份可添加20l矿物油覆盖。 (3) PCR仪的参数设置 94 2 min 94 30sec 35 cycles 62 30sec 72 30sec 72 5 min(4) 琼脂糖凝胶电泳检测 反应结束后，取5l PCR产品，加入1l 6或10 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min，观察产品的大小。3、 重组质粒大小鉴定（1） 用无菌牙签从上述新的筛选平板上挑取PCR反应阳性菌落、，接种于含Amp 50g/mL的5mL LB液体培养基中，37下振荡培养12h。（2） 配制试剂： 溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L； 溶液II：NaOH溶液（内含1% SDS）：0.2 M； 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸，28.5 mL H2O； 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1） 氯仿 TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，其中含RNA酶（RNaseA）: 20 g/ml 醋酸铵（pH7.58.0）: 7.5 mol/L 异丙醇；70%乙醇；无水乙醇。（3） 吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。（4） 离心(8 000rpm，1分钟)，弃上清液。（如想提取多一点DNA，再吸取1.4 ml菌液至同一离心管中，离心，弃上清液）（5） 加入150 L 溶液，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。（6） 加入200 L溶液，加盖后温和颠倒56次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。（7） 加入150 L预冷的溶液，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5分钟。（8） 离心(14 000rpm，10分钟,4 )，移取上清液于另一干净离心管。（9） 向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。（10） 移取上层水相溶液（约450L）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。（11） 移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30分钟。（12） 离心(14 000rpm，10分钟，4)，倒掉上清液。（13） 加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5 分钟，倒掉上清液。（14） 真空抽干或室温自然干燥（15） 加3040L TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10分钟，降解RNA杂质，琼脂糖凝胶电泳或-20保存备用。（16） 琼脂糖凝胶电泳（1%）：称取0.5g琼脂糖粉末，加入50ml 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5L溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。（17） 每位同学各取5L质粒DNA加入1L 6loading buffer混匀，进行点样。（18） 电泳条件：120v，25分钟；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。（19） 以pGEM-T作对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移速度较慢。4、 重组质粒酶切鉴定 利用CaM5片段上的特异酶切位点Hind来检验，该片段上两个位点间的DNA是219bp。（1）酶切反应 酶切反应液的配制: Hind 1l 10M buffer 2l 质粒 5l ddH2O 12l 酶切反应条件：37水浴23小时。（2）电泳检测 反应结束后，向反应液中加入2.2l 10loading buffer，混匀以停止酶切反应，所有22.2l样品均点在同一个点样孔中。电泳条件：120V,45分钟左右。电泳后，观察酶切结果是否与预期的相符，即观察产品的大小。5、 重组质粒的进一步PCR鉴定(1) PCR反应混合液的配制 (10l) 10 x PCR buffer 1.0l dNTP mixture 0.8l 前向引物 (P1) 0.4l 反向引物 (P2) 0.4l 质粒 0.2l rTaq酶 0.1l 灭菌蒸馏水 7.1l （注：dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM前向引物(10uM)为： 5-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3 反向引物(10uM) 为： 5-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3）所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加20l矿物油覆盖。 (2) PCR仪的参数设置 94 2 min 94 30sec 35 cycles 62 30sec 72 30sec 72 5 min(3) 琼脂糖凝胶电泳检测反应结束后，取5l PCR产品，加入1l 6或10 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min，观察产品的大小。三、结果与分析1、菌落直接PCR 琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1。 marker 图1菌落直接PCR的琼脂糖凝胶电泳检测结果 图1中，为已知的pET32CaM5菌落质粒，对比可知，、为阳性转化子，为阴性转化子，因此，四个菌落（、）中有3个（、）呈阳性。再对比marker可知，、与的窄条带大小均为6130bp，与pET32质粒大小相符；宽条带大小均为219bp，与CaM5片段大小相符。综上初步判断，、所代表的菌落为所需鉴定的转化子，即含pET32CaM5的菌落。2、重组质粒大小鉴定 琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2。 marker 图2重组质粒大小鉴定的琼脂糖凝胶电泳检测结果图2中，对比marker可知，、条带大小均为6130bp，符合pET32CaM5质粒的理论大小，