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试剂盒提 DNA 的原理基因组 DNA 提取试剂盒简介DNA 是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等试验,获得高分子量和高纯度的基因组 DNA 是非常重要的前提,因此基因组DNA 的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。Solarbio 公司提供各种不同样品基因组 DNA 提取试剂盒,如植物、动物、细菌、细胞、血液、酵母等基因组DNA 提取试剂盒。所提取的基因组纯度高,片段大小在 50kb 左右。用户可根据需要选用不同的 试剂盒来进行不同样品的抽提。一、基因组 DNA 提取的原则1、保证核酸一级结构的完整性 (因为遗传信息全部储存在核酸一级结构中,故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基层 )。2、排除其它分子(如蛋白质、多糖,、脂类、有机溶剂等)的污染,使 下游试验顺利进行。二、基因组 DNA 提取的原理和方法DNA 与组蛋白构成核小体,核小体缠绕成中空的螺旋管状结构,即染色丝,染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中,外有核膜及胞膜。从组织中提取 DNA 必须先将组织分散成单个细胞,然后破碎胞膜及核膜,使染色体释放出来,同时去除与 DNA 结合的组 蛋白及非组蛋白。1、样品预处理从各种不同来源的样品 ( 如细菌、酵母、血液、动植物组织细胞等 )中提取高纯度的基因组 DNA,因细胞结构及所成分不同,样品预处理方式也不同,以下简单介绍常用提取材料的预处理方式,若需详细了 解,请参考本公司各基因组 DNA 提取试剂盒说明书。部分样品预处理方式植物材料液氮研磨动物材料匀浆、液氮研磨培养细胞蛋白酶 K 处理 细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨血液红细胞裂解液去红细胞2、细胞裂解CTAB 法:适用于植物组织、真菌等。CTAB 是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7M NaCl) 是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、多酚等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。SDS 法:适用于细菌、血液、酵母、动物组织、细胞等。SDS 是一种阴离子去污剂,可溶解细胞膜,裂解细胞,使蛋白质变性、 染色体解析。其它裂解方法:物理方式:机械剪切、超声波破碎、研磨匀浆等 化学方式:异硫氰酸胍、碱裂解等酶法:蛋白酶 K3、DNA 分离纯化纯化要求:核酸样品中不应存在对酶(如核酸内切酶、DNA 聚合酶等)有抑制作用 的成分。其它生物大分子如蛋白质、多糖、多酚和脂类分子等污染应降低到最 低程度。排除其它核酸分子的污染,如提 DNA 时应去除 RNA,反之亦然。纯化方法:细胞破碎后,常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化 DNA ,主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。因硅基质材料可特异吸附核酸 DNA,使用方便、快捷,不需要使用有毒溶剂如酚、氯仿等,使得提取基因组像过滤一样简单,因此硅基质材料成为大规模分离纯化 DNA 的通用方法。硅基质材料吸附核酸的原理:主要利用 DNA 在高盐低 pH 值环境下与硅基质材料相结合,在低盐高 pH 值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理可能是高浓度盐离子破坏了硅基质水分子结构,形成阳离子桥,当盐被清除后,再水化的硅石破坏了基质和 DNA 之间的吸引力, 因而 DNA 从硅基质上被洗脱下来。注意事项:尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破 坏。减少化学物质对 DNA 的降解,为避免过酸、过碱对 DNA 双链中磷酸二 酯键的破坏,操作多在 pH 值 4.0-10.0 的条件下进行。防止基因组 DNA 的生物降解,主要是 DNase 降解基因组 DNA,DNase需二价金属阳离子如 Mg2+ 等的激活,可用 EDTA 等金属离子螯和剂螯 和 Mg2+ 以抑制 DNase 的活性。减少物理因素对 DNA 的降解,物理降解因素主要包括机械剪切力 (如剧烈振荡、搅拌等),细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂, DNase 大量释放,样品反复冻融和高温等。4、DNA 洗脱收集DNA 的洗脱效率取决于以下重要因素:洗脱液成分:采用硅基质膜吸附的 DNA,可将 DNA 在低盐高 pH 值条件下洗脱下来。pH 值在 7.0-8.5 之间洗脱效率较高,pH 值低于 7.0 则洗脱效率很低。一般基因组提取试剂盒中的洗脱缓冲液就是 TE(pH8.0) ,既为 DNA 从硅基质膜上洗脱下来提供良好的 pH 环境,其中的 EDTA 又能保证 DNA不被 DNase 降解,同时由于 EDTA 浓度非常低,对核酸内切酶、DNA 聚合酶的影响非常微弱,不影响后续试验,可放心使用。洗脱液体积:当洗脱液体积小于 30ul 时,洗脱效率很低且不稳定;当洗脱液体积在 50-200ul 时,洗脱效率稳定在 80-90,并可保证得到最大产量, 因此洗脱液体积不能小于 30ul。加洗脱液部位:100-200ul 洗脱液能完全覆盖硅基质膜,DNA 的洗脱量可得到保证,但当洗脱液体积较少如 30-50ul 时,须在硅基质膜中间部分悬空滴加 洗脱液,以确保少量的洗脱液能完全覆盖硅胶膜。洗脱液的温度:在加洗脱液之前,先将洗脱液在 60-75水浴中预热 10 分钟,可有 效提高 DNA 的洗脱效率。洗脱时间和次数:加入预热的洗脱液后,可在室温放置 2-5 分钟使 DNA 完全溶解在洗脱液里通过离心而洗脱下来。同时可进行二次或三次洗脱,即将前次洗脱下来的洗脱液再上柱、离心,使前次没有洗脱下来的 DNA 再次溶解 在洗脱液里,从而提高 DNA 的产量。5、DNA 的定量及检测提取得到的 DNA 片段需从分子质量、浓度、纯度等方面进行检测,从 而判断 DNA 质量。用琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 分子质量:得到的基因组 DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。Solarbio 公司的基因组 DNA 提取试剂盒提取的不同材料基因组 DNA 片段大小一般在 50kb 左右,能很好地满足后续试验的要求。通常用琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 分子质量时,以溴酚蓝为示踪染料,EB 染色,紫外观察,并与 DNA 分子量标准对照即可判断所提 DNA 的平均分子量。高质量的基因组 DNA 应显示为单一条带,如 DNA 降解则 表现为弥散条带。用紫外分光光度计检测 DNA 浓度和纯度:浓度测定:DNA 在 OD260 处有显著吸收峰,OD260 值为 1 相当于大约 50ug/ml 双 链 DNA。以下简单介绍 OD260 的测定方法:所提基因组 DNA 样品=100ul进行 OD260 值测定的待测样品 =20ul 所提基因组 DNA 样品 +180ul TE=200ulDNA 稀释倍数=200ul/20ul=10 倍如 200ul 待测样品 OD260 值=0.2待测样品浓度(即 100ul 基因组 DNA 样品浓度)=50ug/mlOD260 值 稀释倍数=100 ug/ml所提 100ul 基因组 DNA 样品总量=100 ug/ml100ul=10ug DNA 纯度测定:一般用 OD260/OD280 值检测 DNA 样品的纯度。正常 OD260/OD280 值约为 1.7-1.9 ,说明 DNA 纯度较好;若 OD260/OD280 值小于 1.7,说明可能有蛋白污染;若 OD260/OD280 值大于 2.0,说明可能有 RNA 污染 或 DNA 已经降解。注:因为 pH 值和离子会影响光吸收值,因此洗脱时如不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,OD260/OD280 值会偏低,但并不表示纯度低。6、DNA 的储存储存溶液:DNA 为两性解离分子,在碱性条件下较稳定,因此一般用 TE(pH8.0)保存。TE 的成分为:10 mM Tris-HCl(Tris 与盐酸形成强的缓冲对);1 mM EDTA(乙二胺四乙酸,能螯合二价金属阳离子,抑制 DNase 的活性);pH8.0( 碱性条件可减少 DNA 的脱氨作用,防止降解)。ddH2O 的正常 pH 值为 7.0 ,可作为 DNA 的储存液,但有些试验室制备的 ddH2O呈酸性(pH 值小于 7.0) ,这不仅影响 DNA 的洗脱效率,而且导致长时间保存的 DNA 容易发生降解。因此建议用 TE 作为 DNA 的长期储存液。 储存条件:为避免 DNA 降解,提取的 DNA 应先进行分装,然后置于-20 或-70 保存,同时注意避免反复冻融造成 DNA 降解。文章链接 :中国化工仪器网http:/www.chem17.com/Tech_news/Detail/105886.html
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