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叶绿体的提取和希尔反应活性检测摘要:通过差速离心法从油菜和青菜中提取叶绿体,并使用显微镜测微尺测量叶 绿体的大小。同时,利用收集到的叶绿体作为实验材料,对希尔反应活性进行检 测,结果表明:高温和药物制剂会使叶绿体失活或者活性大大降低,从而影响希 尔反应。关键词:;差速离心法;叶绿体;希尔反应前言:叶绿体是植物细胞中极为重要的一种细胞器,同时绿色植物通过叶绿体进 行光合作用制造氧气,供人类呼吸,对人类也是至关重要,因此对叶绿体进行一 系列的研究就显得很有必要。在提取叶绿体的时候采用研磨方法使细胞破碎得到 匀浆液,采用差速离心法分离到较纯的叶绿体,并用显微镜测微尺测量所得叶绿 体的大小。利用提取到的叶绿体进行对希尔反应活性的检测,主要是向光照后的 叶绿体溶液中加入2,6-二氯靛酚(2, 6-DICP),用分光光度计检测其OD值,通 过观察单位时间内 OD 值的变化间接得出光合作用产物 H 的产量及叶绿体活性的 大小,从而总结出影响希尔反应活性的因素。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 生物材料油菜,青菜1.1.2 器材 小塑料盆,研钵,漏斗,纱布,离心管, 5ml 移液管,大橡皮头,试管,试管架 载玻片,盖玻片,比色杯,离心机,天平,水浴锅,分光光度计,光照培养室, 显微镜,显微镜测微尺1.1.3 试剂石英砂,冰块,提取介质:0.5mol/L 蔗糖、10mmol/L NaCl;10mmol/L 2,6-DICP 溶液;2%Tri ton X-100.1.2 方法1.2.1 提取叶绿体(1) 在两个小塑料盆中装上冰块,其中一只装半盆冰块,从冰箱中取出一个冷 冻的研钵,将研钵放入这个小塑料盆的冰块中。另一只小塑料盆装满冰块,将离 心管插入其中预冷。(2) 称取青菜叶和油菜叶各5g,分别剪碎,分别放入两个研钵,加入10ml预 冷的提取介质和少许石英砂,在冰浴中迅速研磨成细浆,补加 5ml 提取介质。将 四层纱布铺在漏斗上再分别将淹没的细浆进行过滤,滤液收集到预冷的离心管中 各 10ml.(3) 室温下800rpm离心3min,离心后分别将上清液倒入另外预冷的离心管中。得到沉淀物A1,A2。上清液在室温下2000rpm离心8min,弃上清液,沉淀物即为 叶绿体,并将沉淀物标记为 B1,B2。(4)在离心管中,分别用2ml介质悬浮沉淀物Al、A2,制成沉淀物悬液后,置 冰浴中备用。分别取一滴悬液,制成装片后用显微镜观察,并记录形态和颜色。(5)分别在离心管中用6ml介质悬浮沉淀物Bl、B2,得到叶绿体提取液,再分 别取一滴制成装片后置显微镜下观察,并记录叶绿体的形态、颜色和数量。(6)适当稀释叶绿体提取液,按1: 6稀释(用提取介质进行稀释),使叶绿体 稀释液的OD值在660nm 1.0左右。1.2.2 叶绿体希尔反应活性的测定(1)取试管架上的试管五支,分别编号各种物质和进行预处理:1、 2、 3、 4、 5,然后按表格所示加入管号1提取介质 (ml)2.5叶绿体稀释液(ml)预处理2, 6-DICP (在 分光光度计室 加入)22.52.5 (青菜)1滴32.52.5 (青菜)沸水浴5min1滴42.52.5 (青菜)5 滴 2% Triton X-100 作用5min1滴52.52.5 (油菜)1滴(2)管作为分光光度计的调零管。当第2, 3, 4, 5管中加入2, 6-DICP后立即 摇匀(加入后立即测量),倒入做了标记的比色杯中,迅速测定620 nm处的OD 值,此即代表作用时间为0时的OD值。(3)然后将比色杯置于日光灯下照光,每隔3 min快速读下OD值,连续进行光 照和读数,并将所测值记录到表格中。1.2.3 显微镜测微尺测量叶绿体的大小(1)正确使用显微镜测微尺测量叶绿体的大小(在40X下进行观察)( 2)具体计算公式为台微尺的格数 目微尺每一小格的长度(um) = X10目微尺的格数 (3)为减少测量时的误差,一般测量 5 个以上叶绿体后计算平均值,并将结果 进行记录2.结果与分析2.1 所制悬液的观察结果(1)A1、A2 悬液在显微镜下为很多透明的不规则的碎片,还有部分较大块的绿 色物体。讨论可知透明碎片为石英砂,大块绿色物体为部分聚集在一起的叶绿体。(2)B1、B2 悬液在显微镜下,很多椭圆的绿色的物体为叶绿体,较小的运动的 则为线粒体。讨论可知,叶绿体和线粒体在离体后依然具有活性。2.2 对叶绿体希尔反映活性的测定2 5 15 01十2号试管 亠3号试管 十4号试管 5号试管表一 各管 OD 值随光照时间的变化光照时间(分)管号、0369121521.2280.8870.6110.4150.3620.35831.5701.5641.5651.5651.5691.57041.2171.2941.3041.3161.3231.33351.2170.8340.5660.4070.4060.400叶绿体希尔反应活性测定中0D值随光照时间的变化图1叶绿体希尔反应活性测定中OD值随光照时间的变化1) 由上表可以计算出各管 OD 值随光照时间变化的斜率,具体结果如下(由 于变化趋势用一整条折线表示不好计算斜率,因此分别取每条折线的第一 点与第三点作为标准点来进行斜率的计算)管号2号管3号管4号管5号管斜率0.1020.0010.0150.136(2)经过分析可得出结论:经过高温和药物处理的3 号管和 4 号管光密度值几 乎没有发生变化,即斜率都接近于0,说明高温和药物会影响叶绿体的活 性,从而降低甚至阻断希尔反映的发生。而比较 2 号管和 5 号管则可以发 现,在相同时间内,青菜中提取的叶绿体所制的悬液 OD 值随光照时间变 化的斜率小于油菜,即在单位时间内产生的 H 较少,因此青菜的光合作用 活性小于油菜。2.3 所测叶绿体的大小表二 青菜叶绿体长度和宽度的测量结果在40倍物镜下,目镜测微尺的每格长度2.4 (um)叶绿体长度(目镜测微尺的格 数)宽度(目镜测微尺的格 数)长度(um)宽度(um)1224.84.82439.67.23224.84.84317.22.45327.24.8平均值(um)6.724.8表三 油菜叶绿体长度和宽度的测量结果在40倍物镜下,目镜测微尺的每格长度2.4(um)叶绿体长度(目镜测微尺的格 数)宽度(目镜测微尺的格 数)长度(um)宽度(um)1327.24.82429.67.23337.24.84214.82.45327.24.8平均值(um)7.24.81) 由以上两表可以看出,青菜和油菜的叶绿体大小相近,青菜叶绿体略比油 菜短,即从个体上来说,青菜叶绿体较油菜叶绿体小。3讨论3.1 所得结果基本与理论相符合3.2 与其他组同学的实验结果相比较,实验结果有别,但是总体趋势是一致的。3.3 通过实验得知,高温和药物制剂等因素会影响叶绿体的活性,从而影响希尔 反应。3.4 思考 青菜的光合作用活性小于油菜,可能就是因为青菜的叶绿体较油菜小,导致光合 作用时作用面积小于油菜叶绿体,所以希尔反应活性才会小于油菜。3.4 注意事项及关键步骤3.4.1 注意事项(1)在提取叶绿体时一定不能过于用力,否则将会损坏叶绿体,提取好的叶绿 体一定要置于冰浴的离心管中。(2)加入 2,6-DICP 时,要在分光光度计室内加,加入后应立即进行测定,在 整个过程中应该严格控制光照时间。(3)应熟练掌握显微镜测微尺的使用方法,在这样的基础上才能快速准确测量 出叶绿体的大小。3.4.2 关键步骤(1)叶绿体的提取(2)分光光度计的使用及对 OD 值的测量(3)显微镜测微尺的正确使用【参考文献】1张红锋编著。细胞生物学实验与探究。华东师范大学出版社
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