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一、实验目的1、了解蛋白酶产生菌的生长情况,学会绘制其生长曲线2、了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理3、掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法二、实验仪器与器材1、器具:UV1000分光光度计、恒温水浴锅、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、移液枪、 吸管、离心管、枪头、摇床、培养基等。2、试剂:福林试剂、0.4mol/L的碳酸钠溶液、0.4mol/L的三氯乙酸、0.5mol/LNa0H 溶液、1mol/L和0.1mol/L盐酸溶液、硼酸缓冲液(pH=10.5)、10g酪素溶液、100ug/mLL 酪氨酸标准溶液3、材料:菌种(产蛋白酶芽抱杆菌斜面菌种)、酶源(蛋白酶发酵液)、产蛋白酶发酵 培养基、蛋白酶活力检测试剂、牛肉膏蛋白胨培养基、酪素培养基三、实验原理将活化好的试验菌种制成菌悬液,转接到产蛋白酶发酵培养基,直接进行发酵,30-32 C 震荡培养48 h,将发酵液过滤或离心,取清夜检测蛋白酶活力。采用福林-酚试剂法。福林 -酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物),由于蛋白质分子中 有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利 用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物,在一定pH值和温度条件下,同酶液反应, 经一段时间后终止酶促反应,经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液,用Na2CO3碱 化,再加入福林-酚试剂显色,蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用 分光光度计在680nm波长处测定,从而计算出蛋白酶的活力。四、实验步骤与内容4.1培养基的配置4.1.1配制牛肉膏蛋白胨培养基配方:牛肉膏 0.3g、蛋白胨 1.0g、NaCl 0.5g、水 1000ml、pH7.07.2、121C灭菌 20min。4.1.2配制酪素培养基牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L酪素10g/L NaCl 4-5g/L PH7.27.4先将酪素用少量2%氢 氧化钠润湿,玻棒搅动,再加适量的蒸馏水,在沸水浴中加热搅拌至完全溶解(10-15min), 补足1000mL蒸馏水,加入其他成分,调PH分装灭菌。4.1.3活化并得到对数期种菌种:将筛选好的并保藏在冰箱里中的未知的产蛋白酶实验菌接种2环于150 ml液体发酵培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)的250 ml三角瓶中,30-32 C摇瓶发酵,在摇床里30C震荡培养16到18小时,目的在于活化菌种并得到对数期菌种。在培养瓶中进行发酵。4.2获取不同培养时间发酵液4.2.1整点8:00时,准时接入已经活化好的对数期菌种,用1000ul的移液枪吸取5ml的对 数期菌液加入到发酵瓶A中(液体为酪素培养基),剩下的对数期菌种菌液置于4C冰箱种 中保藏于。并同时将A号发酵瓶放到摇床中,继续30C震荡发酵。在直到20:00时将放在冰箱中保藏的菌种液(活化的对数期菌种)取出5ml接种到B号发酵 瓶中。并放在30C的摇床中继续发酵。4.2.2发酵过夜之后,在8: 00时,将放在冰箱中保藏的菌种液(活化的对数期菌种)取出 5ml接种到C号发酵瓶中。立即从A、B、C号瓶移取发酵液5ml到对应的离心管中。A瓶取 样分别对应的编号是12、13、14、15、16、17、18对应培养时间为24h、26h、28h、30h、 32h、34h、36ho B瓶取样分别对应的编号是6、7、8、9、10、11对应培养时间为12h、14h、 16h、18h、20h、20h完成全部取样。C瓶取样分别对应的编号是0、1、2、3、4、5对应培 养时间为0h、2h、4h、6h、8h、10h。并且全部放到4度冰箱封存。4.3配制蛋白酶活力检测试剂:4.3.1福林-酚试剂:向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2W04.2H20)、25g 钼酸钠及700mL的去离子水,再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL,充分混合后,接上回 流冷凝管,以文火回流10h,结束后再加入150g的硫酸锂(LiS04)、50mL去离子水及数滴溴 水,再继续沸腾15min,以驱除过量的溴,冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色,需再重复滴 加溴水的步骤),加去离子水定容至1000mL乱,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中,贮于冰箱中 可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。4.3.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g,加去离子水定容至1000mLo4.3.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g,加去离于水溶解后,定容至1000mLo4.3.4 氢氧化钠溶液 c(Na0H)=0. 5mol/L4.3.5 盐酸溶液 c(HCI)=lmol/L 及 0. lmol/L4.3.6磷酸缓冲液(pH=7.5 ),适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na,HP0,12H,0)6. 02 g和磷酸二氢钠(NaH,P0,2H,0)0. 5g ,加水溶解并定容至IOOOmL4.3.7 l0g/L酪素溶液称取酪素l.OOOg,精确至0.00 lg,用少量0.5m ol/L氢氧化钠溶液湿润后,加人适量的 各种适宜pH的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转人 100mL容量瓶中,用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。4.3.8 100“g/mL酪氨酸溶液:精确称取0.100g酪氨酸,逐步加入lmol/L盐酸6ml溶解后,用O.lmol盐酸定容至100mL 得lmg/ml酪氨酸溶液,取此溶液10ml,用O.lmol盐酸定容到100ml,放入4度冰箱中保存。4.4标准曲线的制作按照如下添加量进行添加:管号酪氨酸标 准溶液的 浓度ug/ml取100ug/ml酪氨酸标准溶液的体积ml取去离子水的体积ml力口 0.4mol/L 的碳酸钠溶 液的体积ml加福尔马林的体积ml测定OD680 值000.01.05.001.001100.10.95.001.002200.20.85.001.003300.30.75.001.004400.40.65.001.005500.50.55.001.00加完之后,置于40+0.2水浴中显色20min,取出,用分光度计于波长680nm, 10mm比色皿, 以不含酪氨酸的对照管为空白,分别测定其吸光度值。以吸光度值A为纵坐标,酪氨酸的浓 度C为横坐标,绘制标准曲线,计算出OD680=1时的浓度,即为吸光常数K值,K=95100。4.5产蛋白酶菌的生长曲线的绘制(1)将编号 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 的 离心管从冰箱里取出,用离心机在设定的转速为3500rpm,离心10min,将要测酶活力的的编 号的上清液倒入另一干净的试管中。沉淀留下。(2)离心管中加入蒸馏水5m l轻微震荡制成悬浮液。(3)将悬浮液加到比色皿中,测其吸光度值。测定的OD60值填入下表编号对照01234567891011发酵时间(h)0246810121416182022光密度值OD600编号12131415161718192021222324发酵时间(h)24262830323436384042444648光密度值OD600根据数据绘制一张以培养时间(h)为X轴,以吸光度值0D600为Y轴的生长曲线。4.6样品吸光度值的测定(1)待测液的制备:选择编号为0、3、6、9、12、16,对应培养时间为0、6、12、18、24、32h的离心管,离心之后的上清液,即为待测酶液。(1)将酪素、三氯乙酸溶液放入400.2 C恒温水浴锅中,预热5min。(3)按下表操作:试管A (空白)试管B (酶试样,需作三测量平行)加酶液1.00 mL加酶液1.00 mL400.2 C,2min400.2 C,2min加三氯乙酸2.00 mL (摇匀)加酪素1.00ml (摇匀)400.2 C,10min400.2 C,10min加酪素1.00ml (摇匀)加三氯乙酸2.00 mL (摇匀)取出静止10min,过滤取出静止10min,过滤取1.00mL滤液取1.00mL滤液加碳酸钠溶液5.0mL加碳酸钠溶液5.0mL加福林酚试剂1.00mL加福林酚试剂1.00mL400.2 C 显色 20min400.2 C 显色 20min于680nm波长,用10mm比色皿于680nm波长,用10mm比色皿测其吸光度测其吸光度将测定的0D68值填入下表编号培养时间(h)蒸馏水调零对照组OD68O 值测定三次OD68O 值平均值样品OD68O值5. 计算:X= AXKX4/10Xn式中:X样品的酶活力,U/mL; A样品平行试验的平均吸光度;K吸光常数;4反应试剂的总体积,mL; 10反应时间lOmin,以lmin计;n稀释倍数。所得结果表示至整数。5.1绘制酶活性曲线绘制一张次以培养时间(h)为X轴,吸光度值OD68O为Y轴的酶活力曲线。6. 实验结论与误差分析
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