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酶联免疫斑点技术介绍一、ELISPOT技术概述1.技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测,英文:(Enzyme-linked Immunospot Assay )。它结合了 细胞培养技术与酶联免疫吸附技术(即ELISA技术),能够在单细胞水平检测细胞因子的分 泌情况。其技术原理,一句话概括就是:用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子,并以酶 联斑点显色的方式将其表现出来(Sedgwick JD 2005)。该技术检测细胞因子具有三大优点:其一,灵敏度高。在一百万个阴性细胞中只要有一个分 泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。这是目前为止,最为灵敏的检测技术,灵敏度比传 统的的ELISA方法高2-3个数量级。其二,单细胞水平,活细胞功能检测。ELISPOT检测的 是单个细胞分泌,而非细胞群体的平均分泌。在检测的过程中,有活细胞培养与抗原刺激阶 段,检测的是活细胞的功能,而非死细胞的遗留物。其三,操作简便经济,可以进行高筒量 筛选。ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程,不使用同位素,不需要大型的、专门的实验 仪器设备。按照标准化的实验操作,一个实验者可以同时处理数百个样品,效率远远高于其 它检测方法(Kalyuzhny AE 2005)。实验设计在96孔培养板上进行,直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜 为基质,包被上特异性的单克隆抗体,用以捕获细胞分泌的细胞因子。(由于涉及到细胞培 养的过程,对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体,该抗体需要无毒,不含内毒 素,亲和力高等特点。)之后,在培养板的孔内加入细胞培养基(现在无血清ELISPOT技术 已经成熟,培养基中可以不再含有血清)、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下,数小时之内,T细胞就会开始分泌各 种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。在洗去细胞之后, 被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合,然后用酶标亲和素再与生物素结合, 进行化学酶联显色,就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。每一个斑点就对应了当初一 个分泌细胞因子的细胞,这些细胞被称为斑点形成细胞(Spots forming cells SFCs)。统计膜 上的斑点的数目,再除以当初加入孔内的细胞总数,就可以计算出阳性细胞的频率。其实验 原理如下所示:1. 特异性的单克隆抗体包被在培养板的孔底部;2.封闭所能结合单瓣的其他部位;3.加入细 胞及以及刺激物培养,阳性细胞分泌细胞因子,被细胞下方的单克隆抗体捕获;4.移出细胞, 洗涤;5.加入生物素标记的第二抗体(和双抗体夹心法ELISA类似);6.加入酶标链霉亲和 素;7加入显色底物,在酶的催化分解下,产生不可溶的色素,就近沉淀在局部的膜上形成 斑点;8.斑点计数(可以人工计数,也可以使用自动的读板仪来计数),数据处理,结果分 析。2. ELISPOT的发展历史ELISPOT方法从创立至今已经有20多年的历史了。1983年,在地球南北两个半球地理位置 相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立的创立了这项技术。一个研究小组位于澳大利亚西 部的柏斯Peth,牵头人是当时正在当地Margaret女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的 Jonathon D. Sedgwich (Sedgwick JD et. al., 1983)。另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德 堡Gothenburg,带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者Cecil C. Czerkinsky (Czerkinsky CC et. al., 1983a)。前者开创ELISPOT方法是为了研究B淋巴细胞分泌IgM抗体的情况(Holt PG et. al., 1984; Sedgwick JD et. al., 1984);而后者除了用于研究B淋巴细胞分泌抗体的情况 (Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c),还应用于大肠杆菌分泌肠毒素(Czerkinsky CC et.al., 1983a)和成纤维细胞分泌纤维连接蛋白(Czerkinsky CC et.al., 1984)的研究中。虽然研究 的对象不一样,但是该实验技术所涉及的原理以及方法步骤和我们现在的标准ELISPOT几乎 完全相同。这二十多年来,ELISPOT基本技术并没有什么重大变化,但是技术进步一直没有停顿,实验 材料的改进了,实验灵敏度与重复性提高了,实验应用领域也拓宽了。1) 底板材质的改进ELISPOT技术从创立之初,检测底板都是使用的普通塑料板,它的蛋白吸附能力差,因此实 验的灵敏度有限。1985年,Moller SA和Borrebaeck CA将膜板引入ELISPOT中(Moller SA et. al., 1985),检测的也是分泌抗体的阳性B细胞。他们引入的是硝酸纤维素膜,获得了远远 优于塑料板的结果。1995年,荷兰Utrecht大学免疫研究所的Schielen P团队(该团队后来 挂靠Utrecht大学,创办了荷兰U-Cytech公司,成为世界上顶级的ELISPOT试剂盒生产商之 一)把一种更优于硝酸纤维素膜的PVDF膜也被引入了 ELISPOT检测中(Schielen P et. al., 1995)。做过Westernblot的人都知道,PVDF膜比硝酸纤维素膜有更优的蛋白吸附性质, 更加精细的显色条带分辨率。因此,PVDF的引入是继硝酸纤维素膜之后,ELISPOT底板材料 的又一次重大突破(McCutcheon M et. al., 1997)。至今,PVDF膜几乎完全取代了 NC膜(Weiss AJ 2005)。反者道之动”。塑料板在被膜板取代之后,沉寂了许多年,现在又开始兴旺起来了(Ronnelid J et. al., 1997; Okamoto Y et. al., 1997)。最著名的塑料 ELISPOT 板当数荷兰 U-Cytech 公司研 发的透明板,已经成为了该公司的一大特色。塑料ELISPOT板的重新兴旺有两个方面的原因: 一方面是技术进步,在塑料材质的改进之后,板底吸附蛋白的能力已经比传统的塑料板有了 很大提高,虽然还赶不上膜板,但是应付ELISPOT实验已经绰绰有余。更高质量的抗体也有 利于塑料板获得更好的ELISPOT结果。另一方面归因于塑料板自身的优势,相对低廉的价格, 简化的操作步骤,简短的实验时间都是塑料板的优势(Ronnelid J et.al., 1997)。此外对于 透明板,还可以在实验中随时观察细胞的状态与密度,这对新手是很重要的。2) 检测内容的多样化在ELISPOT技术创立之初,主要用于检测B淋巴细胞分泌的抗体,包括各种类型的免疫球蛋 白,包被的材料是特异性的抗原或者抗体的抗体(Holt PG et. al., 1984 ; Sedgwick JD et. al., 1984)o B细胞分泌的抗体一般的量比较大,容易检测,即使早期ELISPOT检测的灵敏度不 够高,检测大量分泌的抗体还是不成问题的(Bjorkander J et. al., 1991; Ahlfors E et. al., 1991;Holmgren J et. al., 1992a)。时至今日,ELISPOT检测还广泛地用来研究粘膜免疫中的抗体分 泌情况(Holmgren J et. al., 2005)。后来随着技术的进步,ELISPOT检测的灵敏度有了大幅 度的提高,以至于可以检测到痕量的细胞因子,于是它的主要应用就转移到检测细胞因子上 来7(Czerkinsky C et.al,. 1988a; 1991; Hutchings PR et. al., 1989)。现在各种常见细胞因子的 检测都有了商业化的试剂盒,使用起来非常方面。能商业化检测的细胞因子包括人类、小鼠、 大鼠、猴子、猩猩的干扰素(Y-IFN)、白介素(IL-2, 4, 5, 6, 10,12等)、颗粒酶(Granzyme B)、肿瘤坏死因子(TNF-a)。目前全球ELISPOT试剂盒的主要供应商有:荷兰U-CyTech 公司、瑞典Mebtech公司、法国Diaclone公司、美国BD Pharmingen公司和R&D公司。他 们的产品各有特点,其中荷兰U-CyTech公司的产品质优价廉,在国内市场居于主导地位。3) 多细胞因子的检测通常的ELISPOT检测每个孔只检测一种细胞因子。如果要在一个ELISPOT孔内同时检测两种 或者两种以上的细胞因子,可以包被两种抗体以捕获两种细胞因子,然后用两种不同的酶联 抗体以及显色剂显出两种斑点来。早在1988年,Cecil C. Czerkinsky就提出并且实现了这种 想法(Czerkinsky C et.al,. 1988b)。但是,双色ELISPOT有一个与生俱来的弱点,那就是斑 点分离的问题。大家知道,斑点的混合色属于物理学上颜料的三原色”问题,两种不同颜色 的颜料如果以不同的比例混合,会出现一系列不同的表观颜色。其中的细微差异,人的肉眼 有时候都难于判断,何况是自动的读板仪。所以,在双色ELISPOT斑点识别上,总会有些混 色的斑点无法正确的识别与分类。为了解决这个难题,人们想到了用荧光元及检测ELISPOT 的方法(Ruedl C et.al., 1994; Sarawar SR et.al., 1994)。不同颜色的荧光混合在一起,只要 加一张滤光片,就可以精确的滤出目标荧光,而遮蔽掉其它颜色的荧光,荧光之间可以互不 干扰。这对于双因子,甚至多因子ELISPOT检测都是十分理想的手段(Gazagne A et.al., 2005)。 但是荧光ELISPOT检测目前还有不足之处。由于荧光素直接偶联在抗体或者亲和素上,缺乏 酶催化底物的那种放大作用,所以灵敏度还无法和化学显色的ELISPOT方法比较(Gazagne A et.al., 2005)。此外,硝酸纤维素膜自身在激发下就会发荧光,所以不适合做荧光ELISPOT 底板材料。PVDF膜也有自身发荧光的问题,虽然不像硝酸纤维素膜那样严重,但是也会造 成背景升高,信噪比下降的问题(Gazagne A et.al., 2005)。荷兰U-Cytech公司已经发开出 了新一代的荧光底板介质Hydrogel,它既有很高的抗体吸附性质,又没有荧光背景。Hydrogel目前存在的唯一问题是保存起来不够稳定,限制了它的推广。综上所述,多细胞 因子检测是ELISPOT未来的一个发展方向,但在技术上还不够成熟,有待于改进。二、ELISPOT的方法由于有商品化的试剂盒,ELISPOT操作本身已经大大简化。目前的ELISPOT试剂盒按抗体的 包被情况分为已包被板的和未包被板的两类。前者实验操作简单,但是背景较高,且价格较 贵,所以应用不如后者广泛。按照ELISPOT底板材料分,可以分为PVDF膜板和非PVDF膜 板。PVDF板由于疏水性的问题,需要用乙醇预先润湿,在洗涤过程中也更复杂一些。各个 公司的试剂盒使用起来大同小异,我们以荷兰U-Cytech公司的PVDF板IFN-y试剂盒威力, 列出其操作方法。1. 实验的准给工作1) 设备与耗材:1. 超净工作台;2. 5% CO2 37C细胞培养箱;3. P20, P200, P1000 微量移液器;4. P300 8通道微量移液器,P300 12通道微量移液器;5. Biosys ELISPOT Reader6. P20, P200, P1000 枪头;7. 多道移液器吸槽;8. 0.5mL, 1.5mL EP 管。2) 溶液配制PBS:用分析纯试剂,Millipore级别的纯水配制,高压灭菌。PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意无菌操作。储存于20-25C,可存放一个月。70%乙醇
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