分子生物学试验设计题一. 假如你进入实验室开始研究一个小鼠DNA结合蛋白的生物学功能：（武汉大学04）（1）、请设计实验确定其编码基因在小鼠细胞内的表达水平？（2）、请设计实验确定该蛋白的那个结构域具有DNA结合功能？（3）、如何确定该蛋白在小鼠体内（invivo）的生物学功能。（1）基因的表达水平用northernblot吧，从氨基酸序列逆推cDNA做探针。（2）构建一个载体，上面有编码不同结构域的DNA和LacZ激活子DNA,形成不同的domain和LacZ激活子的activationdomain融合蛋白。然后LacZ操纵子后面加个报告基因。如果是某个domain有结合功能的话,报告基因就会表达。（3）反向遗传学方法，用定点诱变直接突变掉相应的基因，获得携带一个突变的小鼠。然后通过杂交获得双突变的小鼠，看看它和正常的小鼠有不同。1. northernblottingS1都可以2. yeasttwohybrid酵母双杂交学了分子生物学大概也知道吧，不细说了。3. 这个有点难度了，是说想知道它是activator还是generaltranscriptionfactor吗？还是说问它是抑制还是增强？一般就是构建带报告基因的质粒，一个有这个蛋白结合的位点，一个没有，然后看报告基因的表达情况，就能知道是抑制还是促进了。第一个问题，用定量PCR和WB检测这个蛋白的在mRNA和蛋白水平上的表达。第二个问题，如果这个蛋白石一个DNA结合蛋白，那么一般是一个转录因子，构建一个这个蛋白所结合的DNA序列荧光素酶报告基因载体，同事吧这个基因分割成数段克隆出来，然后构建表达载体。将报告质粒和表达载体共转染，通过检测报告基因的表达来确定这个蛋白的DNA结合结构域。第三个问题其实最简单，用SiRNA或者是PMO等反义技术把这个基因的表达阻断就行了，分析细胞的代谢，信号通路等各个方面来确定功能。二. 已知一个基因a是可激活调控的，分子B可以激活它。已知在基因a的上游处有一段序列CAGTCA,可以被蛋白质C结合，设计三个实验证明序列CAGTCA有没有参与基因a的转录调控。（武汉大学2011）在相应的带有A基因及其调控序列的细胞内。1.第一组，加入C蛋白，这时检测A基因产物，无。2第二组，加入B分子，C蛋白，检测A基因产物，有。3第三组，加入B分子，检测A基因产物，有。且量与第二组持平。三. 如何设计一个实验，能够证明DNA翻译时阅读mRNA模板的方向是从5端到3端的？翻译的起始部位总是在mRNA的5端，终止密码总是在mRNA的3端，因此翻译有方向性，蛋白质合成总是从N末端开始，到C末端止。在哺乳动物中，N末端的第一个氨基酸为甲硫氨酸，但有时在多肽链释放后，甲硫氨酸则被水解掉。mRNA的5前导序列与3尾随序列不被翻译。四. 请设计一个实验证明RNA聚合酶在完成转录后是否还会重新结合上先前转录后的解聚同一sigma亚基？（2002北大）五、获得一个功能未知的基因克隆后，怎样才能阐明该基因的功能？请你根据自己熟悉的某种真核生物提出具体的研究方案。（2000中科院）1、组织细胞定位，比如是膜蛋白还是胞内蛋白什么的。2、knock-downknock-outoverexpression3、根据基因序列推知其表达蛋白的一级序列，用生物信息学方法进行结构和功能的预测，再实验验证。反义RNA技术构建该基因的反义RNA,运用转基因技术，转化受体。由于反义RNA的核苷酸序列与mRNA互补。当两者互补结合时，可阻止mRNA翻译产生蛋白质。这样即使基因有活性也不会有蛋白质产物，从而抑制基因的表达，实现删除基因的目的。观察转基因的植物或动物等的性状，以此分析克隆基因的功能。