重组人干扰素a 2b凝胶Chongzu Ren Ganraosu a 2b NingjiaoRecombinant Human Interferon a 2b Gel本品系由高效表达人干扰素a2b基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后，加入凝 胶基质制成。含适宜稳定剂、防腐剂，不含抗生素。1基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。2制造2.1 工程菌菌种2.1.1 名称及来源重组人干扰素a2b工程菌株系由带有人干扰素a2b基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌 株。2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。2.1.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。2.1.3.1 划种 LB 琼脂平板 应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。2.1.3.2 染色镜检 应为典型的革兰阴性杆菌。2.1.3.3 对抗生素的抗性 应与原始菌种相符。2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做） 应为典型的大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。2.1.3.5 生化反应 应符合大肠杆菌生物学性状。2.1.3.6 干扰素表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。2.1.3.7 表达的干扰素型别应用抗a2b型干扰素参考血清做中和试验，证明型别无误。2.1.3.8 质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。2.1.3.9目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做） 目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。2.2 原液2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发 酵罐接种用。2.2.2 发酵用培养基 采用适宜的不含任何抗生素的培养基。2.2.3 种子液接种及发酵培养 在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜的温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺， 并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质 粒丢失率检查（附录 IX G）。2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集处理菌体。2.2.5 初步纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。2.2.6 高度纯化 经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1 项要求，即为人干扰素 2b 原液。加入适宜稳定剂，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。2.2.7 原液检定按3.1项进行。2. 3半成品制备采用的基质应符合凝胶剂基质要求（附录I M）。2.3.1配制与除菌应按经批准的配方进行。2.3.2凝胶制备应按批准的工艺进行。凝胶剂应均匀、细腻，在常温时保持胶状，不干涸或液化。2.3.3半成品检定按3.2项进行。2. 4 成品2. 4. 1 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。2. 4. 2 分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。2.4.3 规格 应为经批准的规格。2. 4. 4 包装应符合“生物制品包装规程”和附录I M的有关规定。3. 检定3.1 原液检定3.1.1 生物学活性依法测定（附录 X C）。3.1.2 蛋白质含量依法测定（附录 VI B 第二法）。3.1.3 比活性为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0X108IU。3.1.4 纯度3.1.4.1 电泳法依法测定（附录IV C）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳法，分离胶胶浓度为15%,加 样量应不低于10p g （考马斯亮蓝R250染色法）或5pg （银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不 低于 95.0%。3.1.4.2 高效液相色谱法依法测定（附录III B）。色谱柱以适合分离分子质量为5-60kD蛋白质的色谱用凝胶 为填充剂；流动相为O.1mol/L磷酸盐一O.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量应不低于 20p g,于波长280nm处检测。以干扰素色谱峰计算理论板数应，应不低于1000；按面积归 一化法计算，干扰素主峰面积应不低于总面积的 95.0%。3.1.5 分子量依法测定（附录IV C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%， 加样量应不低于1.0 g,分子质量应为19.2kD1.92kD。3.1.6外源性DNA残留量每1支应不高于10ng （附录IX B）。3.1.7 宿主菌蛋白残留量应不高于总蛋白质的0.10% （附录IX C）。3.1.8 残余抗生素活性依法测定（附录IX A），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。3.1.9等电点主区带应为4.06.7,供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致（附录IV D）。3.1.10紫外光谱扫描用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100p g/ml500p g/ml，在光路1cm、波长 230nm360nm下进行扫描,最大吸收峰波长应为2783nm （附录II A）。3.1.11肽图（每半年测定一次）依法测定（附录VIII E），应与对照品图形一致。3.1.12 N-末端氨基酸序列（至少每年测定一次）用氨基酸序列分析仪测定，N-末端序列应为：（Met）-Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。3.2半成品检定3.2.1生物学活性应按经批准的方法预处理供试品，依法测定（附录X C），应符合规定。3.2.2无菌检查应按经批准的方法预处理供试品，依法进行（附录XII A）,应符合规定。3.3成品检定除外观、装量检查外，应按经批准的方法预处理供试品后，进行其余各项检定。3.3.1 鉴别试验按免疫印迹法（附录VIII A）或免疫斑点法（附录VIII B）测定，应为阳性。3.3.2 物理检查3.3.2.1 外观 应为透明水凝胶剂。3.3.2.2 装量依法检查（附录I A），应符合规定。3.3.3 pH 值应为5.07.5 （附录V A）。3.3.4 生物学活性 应为标示量的 80%150%（附录 X C）。3.3.5 微生物限度依法测定（附录XII G），应符合规定。4. 保存、运输及有效期于020C,避光处保存和运输。自生产分装之日起，按批准的有效期执行。5. 使用说明应符合“生物制品包装规程”、附录IM的规定和批准的内容。