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wordBD FACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤一、开机1) 先打开净化交流稳压电源,其次打开110V稳压输出电源,再次打开流式细胞仪,最后打开计算机。在图上用明显颜色标记出减压阀位置2) 向前拉开储液箱抽屉,检查鞘液筒、废液筒水量,如需充填鞘液,先将减压阀红色箭头所示方向调在VENT位置箭头方向,再参加超纯水,保持水位在鞘液桶的3/4左右,加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN位置。二、开启CellQuest 软件、编辑实验文件1在苹果菜单下点击在屏幕下方点击CELLQuest第四个图标启动软件。桌面会出现一Untitled 实验文件,可点击实验文件的左右上角的放大钮红绿色,将实验文件窗口放大。2从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击,拖曳对角线至适当大小,然后放开鼠标。出现散点图对话方框当所要编辑的图窗口被选中时,会在其四角出现四个小黑块。3在出现的散点图对话方框中点击Plot Source,选择Acquisition and Analysis (收取、分析) ,确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。说明:散点图Dotplot,又称二维散点图是流式分析最常用图谱,它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中, 横坐标X轴横坐标X轴为为荧光1强度的相对值,单位是道数,纵坐标Y轴如此通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和纵坐标Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024;双荧光标记时,第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024,X轴为为荧光1强度的相对值,单位是道数,Y轴如此通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数,并依需要选择之FSC:细胞大小,SSC:细胞折射率,FL1:FITC绿色荧光,FL2:PE橙色荧光,FL3:PerCP红色荧光。4从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能,可复制一个同样大小的散点图,在出现的对话方框内选择X轴:FL1-H 1024,;如果是双标,Y轴选择:FL2-H 1024(根据实验检测样品确定所选通道,本步骤选FL1/FL2来说明),如果是单标,Y轴选择:SSC-H。点击OK,FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。说明:散点图Dotplot,又称二维散点图是流式分析最常用图谱,它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中, 横坐标X轴和纵坐标Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024;双荧光标记时,第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024,X轴为为荧光1强度的相对值,单位是道数, Y轴如此通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因实验需求来修改所有图谱中显示之参数。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数,并依需要选择之FSC:细胞大小,SSC:细胞折射率,FL1:FITC绿色荧光,FL2:PE橙色荧光,FL3:PerCP红色荧光。5在工具板中选择四象限工具,在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在x,y101,101处,这些象限将指定阴性/阳性区域。加直方图的描述6从工具板中点击直方图图示,在实验文件的空白区点击,拖曳对角线至适当大小,然后放开鼠标。单色荧光只需一个直方图,和第二个散点图一样,横坐标选择FL-1,纵坐标默认为Counts;假如是双色荧光,需画2个直方图,一个横坐标选择FL-1-1024,另一个横坐标选择FL-2-1024;7在上面直方图中画出M1和M2,其中M1代表隐性数目一般标示是101,M2代表阳性数目除M1以外所有的局部。8从Stats菜单中选择Quadrant Stats象限统计,5步骤中的点图将分为四个象限。三、建立仪器和计算机之间通讯从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer (快捷键Win+b),此时会出现Acquisition Control 对话方框。四、仪器设置文件注意:实验数据质量,取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改,研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件Instrument settings,含信号器高压Detector/ Amps,阈值Threshold,荧光补偿pensation等仪器条件的组合。一般而言,仪器设定的顺序为Detector/Amps - Threshold - pensation。1检查现有仪器条件,从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC根据实验样品确定,一般细胞选择LIN,细菌选择LOG,其它FL1-3为LOG对数放大,将其拖至空白区。2从Cytometer菜单中选择Threshold,出现 Threshold 窗口在Threshold 窗口:确认FSC为设阈参数,初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。3从Cytometer菜单中选择pensation,确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白区。五、上样品、设置仪器使仪器处于High RUN,样品管支撑架左移,上阴性对照管样品,支撑架回位。确认Acquisition Control 窗口中 Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据,用于仪器设置),点击Acquire。1、调节FSC/SSC探测器电压观察FSC/SSC图的变化。FSC电压(Voltage)预设为E00,可调节 Amp Gain 从1.009.99 使主要细胞群得以清楚显示如细胞较大,将FSC电压设置于E-1;较小细胞,将FSC电压设置于E01。调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC图的原如此,在于能得到一独立离散的细胞族群,该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后,点击Acquisition Control 窗口中的Pause。2、Gating 圈选细胞检品中,常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射FSC与侧方散射SSC的二维位图,即散射光图谱Scatter Plot,来圈选出不同细胞群的X围,选择性显示出有意义的细胞群体,如如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。1在工具板中选择多边形的Region,在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1 区域如如下图。分析样品时,区域内细胞应会呈现成红色,可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。如果要删除R1区域,您可以在工具列中点选Gates Region list,以鼠标点选R1,再按Delete键删除R1区域。删除R1区域后,可用绘图工具板,重画R1。2) 选取希望Gate的FL1/FL2散点图,从Plots菜单中选择Format dot plot。在出现的对话方框内,将No Gate 改选 G1=R1。点击OK。3、调节FL1、FL2的探测器电压1点击Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中调节FL1、FL2的电压,使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之100-101处。2在Threshold 窗口,适当地提高FSC阈值52,以去除碎片或低阶噪音。唯需注意不要切掉主要细胞族群。3点击Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去阴性对照管,关闭Detector/Amps、Threshold窗口,我们已设定好有意义细胞群之自体荧光,不要再改动Detector/Amps、Threshold等数值。4、调节荧光补偿说明:最适化的最后一步是调节光谱重迭。如是单色荧光实验可跳过此步骤如是2色样本,必要时需调节FL2-%FL1,FL1-%FL2假如3色样本,必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿。1 High RUN,换上单染CD3-FITC管。点击Acquisition Control窗口中的Acquire。调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。补偿调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。调节完毕,点击Acquisition Control窗口中的Pause。2移去单染CD3,换上单染CD19-PE管。点击Acquisition Control窗口中的Restart。调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。调节完毕,点击Acquisition Control窗口中的Pause。3.最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机,点击Acquisition Control窗口中的Restart,确定三群细胞工整垂直。当您已完成2色荧光之光谱重迭时,点击Acquisition Control窗口中的Pause、Abort。4移去样本管,换上dH2O管,让仪器暂且处于Standby状态。关闭pensation窗口。您已完成2色荧光之最适化。六、收集实验数据1决定储存细胞总数:预设之储存细胞总数为10000。如需修改,从Acquire菜单中选择Acquisition & Storage,并在出现的窗口功,确认Collection Criteria从10000 of All,再点击OK。2) 找个档案匣准备储存数据,本机所有数据都贮存在D盘data盘中,按实验日期编排。从Acquire 菜单中选择Parameter Description,出现Parameter Description对话方框。点击Folder,并在随后出现之对话方框,选择Your Folder或新建活页夹,点击此对话方框的Select Your Folder一般用实验日期来命名Folder。3命名即将储存之文件名:点击Parameter Description对话方框的File,出现文件名编辑窗口,输入文件名根据实验来决定,点击此对话方框的OK。4 Optional:如有需要,可选择或在P1-P5后的空格中输入相关参数名。如P1:Size, P2:Granularity, P3:CD3 FITC。输入参数名会存入实验档案中,显示在图谱上。5计数器Counters:从Acquire 菜单中选择Counters. 窗口会显示样品分析速率、与总数进度6开始收集实验数据。LOWRUN根据Counters来调节速度,一般保持在700-800/Second,将第一管样品放到检测区,在Acquisition Control窗口中,将 Setup 改成 Setup,此时CellQuest会自动显示 Your Folder文件名为资料文件名。点击“Acquire 便可启动样品之分析测定与数据储存。当计算机成功地收取足够数据,会自动储存
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