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淀粉脱支后环化制备大环糊精许燕;周星;金征宇 【摘 要】以普通玉米淀粉、木薯淀粉、高直链玉米淀粉为底物制备大环糊精,先利用异淀粉酶将这3种底物脱支处理以后,再利用栖热水生菌4-a-糖基转移酶的环化 作用来生产大环糊精.结果表明:经过脱支处理以后,普通玉米淀粉大环糊精的最高转 化率从20.3增加到 33.6(1.7 倍);木薯淀粉大环糊精的最高转化率从 16.82增 加到32.4(1.9 倍);高直链玉米淀粉大环糊精的最高转化率从24.53增加到 44.07(1.8 倍).因此,该方法是种有效的大环糊精生产方法,具有工业化应用的潜能.【期刊名称】食品与发酵工业年(卷),期】2013(039)011【总页数】6页(P62-67)【关键词】4-a-糖基转移酶;普通玉米淀粉;木薯淀粉;高直链玉米淀粉;大环糊精【作 者】 许燕;周星;金征宇【作者单位】 江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡,214122;江南大 学食品学院,江苏无锡,214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无 锡,214122;江南大学食品学院,江苏无锡,214122;江南大学食品科学与技术国家重 点实验室,江苏无锡,214122;江南大学食品学院,江苏无锡,214122正文语种】 中 文大环糊精(cycloamylose)是一类由9个及9个以上葡萄糖残基连接而成的环状大 分子,具有水溶性好、黏度低、不易回生等特点。与3种常见环糊精a-CD、p- CD和y-CD(聚合度分别为6,7和8)相比,大环糊精由于分子环尺寸增大,而具 有更大的疏水空腔,因而可以包埋各种不同大小的客体分子,起到保护客体分子的 作用1。在医药领域,大环糊精可以与布洛芬、氟比洛芬等药物发生相互作用, 起到稳定药物,提高药物生物利用率的作用24。在蛋白折叠系统中,大环 糊精可以作为一种有效的人工分子伴侣,阻止蛋白分子聚集并提高蛋白分子的折叠 程度5。在食品领域,大环糊精可以作为食品的回生控制剂、食品风味物质的 缓释剂。另外,近期的几项研究标明,大环糊精在分子生物学领域也具有极大的潜 在应用价值。如:Toita等人报道大环糊精可以作为生物材料应用于基因传递系统中6 ;Toita等人将大环糊精作为纳米凝胶应用于小分子干扰RNA的传递过程 7。因此,大环糊精在食品、医药等领域显示出巨大的应用潜力。目前较为普遍的是以马铃薯直链淀粉为底物,通过4-a-糖基转移酶分子内转糖基 作用(环化作用)来制备大环糊精,但是由于马铃薯直链淀粉制备工艺复杂、价格昂 贵,使得大环糊精的工业化生产受到极大的限制。另外,由于4-a-糖基转移酶的 最适底物是直链淀粉,其作用于支链淀粉制备得到的大环糊精量很小,因此含有大 量支链淀粉的天然淀粉无法直接用于大环糊精的工业化生产。本研究通过淀粉脱支 处理的方法,使得天然淀粉中的支链淀粉转化为短链的直链淀粉之后,再利用4- a-糖基转移酶进行大环糊精的生产。通过这种方法,可以利用价格低廉的天然淀 粉来生产大环糊精,大大降低了大环糊精的生产成本,具有工业化生产的潜能。 1材料与方法1.1 实验材料马铃薯直链淀粉,Sigma公司;普通玉米淀粉、木薯淀粉、高直链玉米淀粉(纯度 99%),杭州普罗星淀粉有限公司;异淀粉酶、糖化酶(根霉属来源),爱尔兰 Megazyme公司;栖热水生菌4-a-糖基转移酶(最适温度70C,最适pH 7.5),经 基因工程菌发酵后纯化得到;大环糊精标品,日本Wak。股份有限公司;其他化学试 剂均为分析纯。1.2 实验仪器双光束紫外可见分光光度计(TU-1900),北京普析通用仪器有限责任公司;电热恒 温水浴锅,上海浦东物理光学仪器厂;低速台式大容量离心机(RJTDL-50A),无锡 瑞江分析仪器有限公司;高速冷冻离心机(BIOFUGE PRIMO R),美国Thermo Electron有限公司;高效液相色谱仪、示差折光检测器(日立RI-5450),日立公 司Shodex OHpak SB-806 HQ 色谱柱、OHpak SB-804 HQ 色谱柱,日本昭和 公司;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS),美国布鲁克道尔顿 公司;CarboPac PA-100色谱柱、脉冲安培检测器Dionex-300,美国Dionex公 司。1.3 实验方法1.3.1 大环糊精的检测基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDITOF MS)分析:准确称取10 mg大环 糊精纯品,溶于1 mL去离子水中,制成10 mg/mL的大环糊精溶液。10 mg/mL的2 , 5-二羟基苯甲酸用作基质,2种溶液等体积混合(各1叫后,点到 点样板上于室温条件下自然风干后进行质谱分析,质谱分析条件为:加速电压19 kV,反射电压16 kV,所有样品均在反射模式下分析。高效阴离子色谱(HPAEC)分析:准确称取10 mg大环糊精纯品,溶于1 mL去离子 水中,制成10 mg/mL的大环糊精溶液用于高效阴离子色谱分析。在高效阴离子 色谱分析系统中,流动相为150 mmoL NaOH溶液,用600 mmoL醋酸钠溶液 进行线性梯度洗脱,流速为1 mL/min,进样量为20 pL,分析时间为70 min 8。1.3.2 大环糊精的定量大环糊精标准曲线的绘制:准确称取100 mg大环糊精标品,加入50 mL水溶解, 最后定容至100 mL,即为1 mg/mL大环糊精标准溶液。分别吸取上述溶液各0、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,再分别加入 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL 去离 子水,混合均匀后,取上述溶液各100 pL,每管中分别加入1 mL碘液 (0.2%KI+0.02%I2),混合均匀后于500 nm处测定吸光值。以吸光值为纵坐标, 大环糊精的含量为横坐标,绘出标准曲线。大环糊精含量的测定:将得到的大环糊精纯品溶解于1 mL去离子水中,稀释10倍 后,取100 pL稀释液,加入1 mL碘液(0.2%KI+0.02%I2),混匀后比色,由标准 曲线计算出样品中大环糊精的含量。1.3.3 淀粉脱支前处理分别准确称取100 mg普通玉米淀粉、木薯淀粉、高直链玉米淀粉,用1 mL去离 子水润湿后,加入9 mL二甲基亚砜,沸水浴1 h至溶液透明后冷却至室温,向其 中加入6倍体积的无水乙醇,5 000 r/min离心10 min沉淀淀粉颗粒。离心结束 后弃上清液,向沉淀物中加入10 mL预热的醋酸钠缓冲液(50 mmoL , pH 3.5), 沸水浴30 min至溶液透明后冷却至室温。向冷却后的淀粉溶液中分别加入1、2.5、5.0、7.5、10 U/g异淀粉酶,40工保温不同时间,测定不同反应时间后体系 中还原力的大小。1.3.4脱支前后淀粉分子质量变化的测定 以高直链玉米淀粉为例,研究脱支前后淀粉分子质量的变化。取脱支处理完全的高 直链玉米淀粉溶液10 mL,通过0.45 pm的过滤膜后,以未脱支处理的高直链玉 米淀粉溶液为对照,进行高压体积排阻色谱(HPSEC)色谱分析。Shodex OHpak SB-806 HQ色谱柱和OHpak SB-804 HQ色谱柱串联后保持柱温50C,超纯水 作为流动相,流速为0.6 mL/min,进样量为100 pL,分析时间为40 min。在上 述色谱条件下分析的葡聚糖标准样品(分子质量为1 000,5 000,12 000,150000, 670 000 u)用于分子质量标准曲线的制作。1.3.5 大环糊精的生产马铃薯直链淀粉生产大环糊精:准确称取10 mg马铃薯直链淀粉,用0.1 mL去离 子水润湿后,加入0.9 mL二甲基亚砜,沸水浴1 h后冷却至室温,向其中加入6 倍体积无水乙醇,5 000 r/min离心10 min后弃上清液,向沉淀物中加入1 mL 预热的Tris-HCI缓冲液(50 mmoL,pH 7.5),煮沸30 min至溶液透明后冷却至 室温。向冷却后的溶液中加入10 U/g栖热水生菌4-a-糖基转移酶,在70C, pH 7.5的条件下反应一定时间。反应结束后,沸水浴10 min灭酶,用4 mL醋酸钠 缓冲液(50 mmoL , pH 5.5)重悬反应液并向其中加入0.4 U/mL糖化酶,50C保 温6 h以去除未反应完全的直链淀粉。反应结束后沸水浴10 min灭酶,变性的酶 蛋白通过10 000 r/min离心10 min去除。取上清液,向上清液中加入10倍体 积无水乙醇,10 000 r/min离心10 min沉淀大环糊精,弃上清液,得到的沉淀 于烘箱中40C烘干12 h后,即得大环糊精纯品。普通玉米淀粉、木薯淀粉、高直链玉米淀粉生产大环糊精:取1mL经脱支处理的 普通玉米淀粉、木薯淀粉、高直链玉米淀粉,沸水浴10 min灭酶后10 000 r/min离心10 min去除变性的酶蛋白。离心结束后取上清,向其中加入6倍体积 的无水乙醇,5 000 r/min离心10 min沉淀脱支后的淀粉颗粒。离心结束后弃上 清,向沉淀加入1 mL预热的Tris-HCI缓冲液(50 mmoL , pH 7.5),煮沸30 min 至溶液透明后冷却至室温。向冷却后的溶液中加入10 U/g栖热水生菌4-a-糖基 转移酶,在70C, pH 7.5的条件下反应一定时间,其余过程同上。2 结果与分析2.1 大环糊精的检测目前,大环糊精的检测最主要的方法为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)以及高效阴离子色谱(HPAEC)2种。MALDL-TOF MS作为一种 新型的质谱检测手段,已经被广泛应用于淀粉以及糖类物质的结构检测 911 本研究中生产的大环糊精的质谱图和阴离子色谱图分别如图1、图2所示。图1 中大环糊精的分子质量和聚合度均已标出,大环糊精相对分子质量的计算公式 为:162n+23,其中n代表大环糊精的聚合度,23为钠离子的相对分子质量。图 中CA代表大环糊精分子,下标n代表大环糊精的聚合度。由图1可知,不同聚 合度的大环糊精相对分子质量均符合上述公式,与文献报道的大环糊精相对分子质 量相一致1213,证明体系中无线性糖类分子的存在,样品纯度较高。 高效阴离子色谱作为辅助的检测手段来检测大环糊精的聚合度分布和结构特征,图 2中洗脱峰上方的数字代表大环糊精分子的聚合度,这一结果与基质辅助激光解析 电离飞行时间质谱结果相吻合,表明由淀粉脱支法生产的大环糊精纯度较高,能满 足实验室研究以及工业化应用的需要。图1大环糊精的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图Fig.1 MALDI-TOF MS analysis of cycloamylose图2大环糊精的高效阴离子色谱图Fig.2 HPAEC chromatogram of cycloamylose2.2 淀粉脱支处理条件的确定 高直链玉米淀粉不同加酶量、不同反应时间下还原力的变化如图3所示。由图3 可知,在不同加酶量条件下,随着反应时间的增加,高直链玉米淀粉的还原力迅速 增加,在反应时间达到12 h后,体系的还原力数值波动较小,基本保持恒定,表 明淀粉脱支反应已达到平衡。因此选择12 h作为脱支反应的最优时间。另外,当 加酶量为7.5 U/g时,反应达到平衡时的还原力最高,表明在该加酶量条件下淀 粉的脱支程度最高,因此选择 7.5 U/g 的加酶量为脱支反应的最佳酶用量。综上, 淀粉脱支的最佳反应条件为:异淀粉酶7.5 U/g ,40工,pH 3.5的条件下反应12 h。2.3 脱支前后淀粉分子量的变化测定 以高直链玉米淀粉为例,在最优的脱支反应条件下,研究其脱支处理前后淀粉分子 量的变化,如图4所示。由图4可知,未经脱支处理的高直链玉米淀粉支链部分 的出峰时间为15 25 min之间;直链部分的出峰时间为
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