21年产100公斤高效植物生长调节剂油菜甾醇内酯项目江西省科技计划项目可行性研究报告计划类别：科技攻关计划项目名称：农业高技术研究与产业化开发项目类别：农业科技攻关计划重大、重点项目课题名称：年产100公斤高效植物生长调节剂油菜甾醇内酯申请单位： 上海威敌生化（南昌）有限公司 （盖章）项目（课题）负责人：张小兵起止年限： 2005-2007通讯地址、邮编： 江西省进贤县工业开发区威化路(331700)联系电话、传真：0791-5690509，8326534 (Email: ryb3399163.com)报告编制单位： 上海威敌生化（南昌）有限公司江西省科技厅制二二年六月一、总论（一）项目的主要内容及技术原理简述本项目的主要内容涉及到一类高效植物生长调节剂的合成技术开发及改进。本项目的技术原理是综合利用现代有机化学合成技术对已有的生产技术进行改进，提高产品得率，减少污染，降低生产成本。植物生长调节剂（plant growth regulator），早期叫做植物激素（plant hormone或photohormone）,正式命名为植物生长调节物质（plant growth substance）,具备以下两个特点：（1）它们不是能够提供能量的营养物质；（2）它们在很低浓度下即可促进或抑制或改变植物的发育进程。在生长物质中，有五大类因普遍存在于植物中而被公认为植物激素，包括生长素（auxin）、赤霉素（gibberellin）、乙烯(ethylene)、脱落酸(abscisic acid)和细胞分裂素（cytokinin）（Scheme 1）。除内生的生长物质以外，一些人工合成的化合物具备上述条件也可广义地称作植物生长调节物质。随着科学的不断发展，新的植物生长调节物继续被科学家们发现，如油菜素内酯(brassinolide)、多胺(polyamine)、膨压素(turgorin)、茉莉酸(jasmonicacid) 、寡糖素(oligosacharin) 、水杨酸(salicyclic acid) 、系统素(systemin) 和玉米赤霉烯酮(zealenone) 等等，原有的种类数量也在增加，生长素有四种，赤霉素有一百零八种之多，细胞分裂素也有二十多种。由于成本等原因，目前运用较多的只有吲哚乙酸系列、细胞分裂素、乙烯、赤霉素和油菜素内酯等等。市场上许多标注为“植物生长调节剂”的产品大多是以这些有效成分复配或混配的产品，一部分是植物生长抑制物质如三碘苯甲酸、抑芽丹、多效唑、烯效唑、矮壮素、助壮素、丁酰肼（商品名“比久）、调节酸和抗逆倒酯等等。虽然目前人们已经合成了许多具有类似作用的植物生长调节物质，但是合成物质的环境相容性无论如何是比不上天然产物的，即使是天然产物如果大剂量使用在自然环境中的残留也会污染环境，正缘于此使用剂量很低（10-710-9）的油菜素内酯格外引人注意，油菜素内酯也因此被誉为第六代植物生长调节物质。 有机化学（organic chemistry）是研究有机化合物的来源、制备、结构、性能、应用以及有关理论和方法学的科学，是化学学科的一个分支，它的研究对象是有机化合物。有机合成化学在高选择性的研究中取得很大的进展，出色地开创了一个又一个新的反应，合成了一批又一批具有高生理活性，结构新奇复杂的分子。金属有机化学和元素有机化学，为有机合成化学提供了高选择性的反应试剂和催化剂，以及各种特殊材料及其加工方法。有机化学以它特有的分离、结构测定、合成等手段，已经成为人类认识自然改造自然具有非凡能动性和创造力的武器，近年来，计算机技术的引入，使有机化学在结构测定，分子设计和合成设计上如虎添翼，发展的更为迅速。在我国，有机化学研究已取得一批重要成果，得到国际同行的重视在经济和国防建设中起了重要的作用。如：甾体化学研究及甾体药物工业的建立；莲心碱，芜花酯等多种有效成分的鉴定；结晶牛胰岛素的全合成，丙氨酸酵母转移核糖核酸的人工合成；天花粉蛋白的研究及其在计划生育中的应用；青蒿素的结构测定、全合成及其抗疟应用；美登素及三尖杉酯碱（抗癌成分）的全合成研究；氟有机材料的研究制备；有机氟化学的研究和脱卤亚磺化反应的发现及应用；砷叶立德用于合成有机化学的研究，有机磷化学，有机磷萃取剂结构与性能的研究；自由基化学及微环境效应等工作都是其中比较突出的例子。（二）项目的目的和意义本项目的目的是运用现代有机合成技术合成一系列油菜甾醇内酯，并运用于农业生产，促进增产增收，具有良好的社会和经济效益。油菜甾醇内酯，又称芸薹素内酯。这是一类以甾醇为骨架的植物内源甾体类生理活性物质。20世纪70年代初，美国农业部Beltsuille中心的Mitchell等在尝试从植物花粉中筛选和分离具有高生理活性物质时，试验了60多种花粉，其中以油菜花粉促进大豆苗生长作用最为突出，但这种活性物质在花粉中的浓度仅百万分之一左右。该中心的Mandava等于1979年从40公斤蜂蜜中收集到4毫克纯的高活性物质，经波谱分析和单晶X衍射确定其结构为（Scheme 1）： (22R,23R,24S)-2,3,22,23-tetrahydroxy-24-methyl-B-homo-7-oxa-5-cholestan -6-one，其化学结构属于甾醇内酯，故命名为油菜甾醇内酯（brassinolide，简称BR）。油菜素内酯对植物的生长发育具有多种生理功能：促进生长、增加植物的抗逆性、延缓衰老和促进细胞的再分化等等，但最突出的生理作用就是促进植物的生长。油菜素内酯可以明显促进绿豆和大豆上胚轴及油菜幼苗下胚轴的伸长，提高水稻、小麦、大豆和棉花等的产量。在园艺作物方面，24-表油菜素内酯可以提高黄瓜、葡萄、西瓜和番茄的结果率，促进芹菜、菠菜和平菇的生长。尽管油菜素内酯与生长素促进生长的作用有协同作用，但油菜素内酯促进生长的信号传导途径与生长素是不同的。在生长素缺乏的条件下油菜素内酯单独也可以促进大豆上胚轴的生长。油菜素内酯促进伸长的启动较生长素缓慢，但在后期的生长促进中比生长素有效。另外，油菜素内酯在生长素缺乏的条件下不能诱导生长素诱导基因SAUR、JCW和GH的转录。大豆中的SAUR对外源的生长素反应非常迅速，2,4-D处理下胚轴之后，2-5分钟内就可以观察到转录的增加，但油菜素内酯诱导不敏感突变体dgt的伸长，却不诱导SAUR的表达，说明油菜素内酯发挥作用不依赖于生长素而进行。Sesse证明抗生长素的化学物质并不影响油菜素内酯诱导的伸长。以上说明油菜素内酯诱导伸长的机制与生长素是独立的。Rumi还发现在油菜素内酯促进伸长的过程中其作用对象是内部组织，它可以改变内部组织细胞壁的物理特性，这是油菜素内酯所特有的作用，生长素诱导伸长的靶位组织为表皮，可能正是这种差别造成了油菜素内酯促进生长的迟效性和后效性。油菜素内酯促进生长的机制也不同于赤霉素，虽然都可以使节间伸长，但油菜素内酯处理的节间较粗，而且油菜素内酯的有效浓度要低得多。赤霉素只是引起细胞变大，而油菜素内酯有双重效应（伸长和分裂），引起伸长、弯曲和开裂。用赤霉素抑制剂ancymidol可以抑制赤霉素引起的绿豆上胚轴的伸长，但对油菜素内酯的促进生长效应无抑制作用。在植物体内, 油菜素内酯的活性水平在油菜素内酯生物合成代谢及去活化等层次上受到精细调控，油菜素内酯的生物合成呈代谢网格状(metabolic grid), 其生物合成酶受到终产物和信号转导的一些中间组分的反馈抑制。从油菜素内酯信号的产生, 包括油菜素内酯的合成活性与水平的调节及运输, 到与膜受体结合引起信号的感知和传递, 并最终引起油菜素内酯诱导基因的表达和特定的生理反应, 是一个连续且相互影响的过程, 并且每一个环节都受到多种内外因子在多个层次上的调节。油菜素内酯作为有重要生理功能的信号分子, 其信号转导途径的第一步就是被其受体接受。油菜素内酯受体的研究进展得益于对油菜素内酯非敏感型突变体的研究。目前, 关于油菜素内酯分子与BRI1的结合方式还不完全清楚, 由于BRI1中含有的LRR结构域通常与一些蛋白或多肽结合, 而不是与甾醇这样的小分子直接结合, 而在拟南芥基因组中已鉴定到2个以上甾醇结合蛋白(steroid-binding protein, SBP), 人们推测油菜素内酯很可能先和一种SBP形成复合体, 再与BRI1结合. 关于突变体brs1 的研究则使人们对BR信号感知的认识进一步深入, BRS1基因编码一种可分泌的丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidase), 并在BRI1信号转导途径的早期发挥重要作用, 但BRS1的作用似乎不是直接加工BRI1受体, 而很可能是加工SBP以使其产生有活性的油菜素内酯结合蛋白, 油菜素内酯分子与这种活性形式的油菜素内酯结合蛋白形成复合体后, 再与BRI1的胞外结构域连接, 进而完成油菜素内酯信号的感知。油菜甾醇内酯的生理活性极高，极微量就能促进植物生长。油菜甾醇内酯对菜豆幼苗有促进细胞分裂和伸长的双重作用，可促进整株生长，包括株高、株重和荚重等，在豆苗第二节间伸长的生物活性测定实验中，用油菜甾醇内酯处理过的豆苗在第二节间的生长速度是对照株的200倍。日本的藤条文雄发现油菜甾醇内酯对水稻、黄瓜、菜豆、葱、土豆、萝卜、番茄、白菜和甘蓝等作物都有明显的促进生长的效果，它还可以使葡萄无核，对柑橘等果树的生长也有一定促进作用。在田间实验中它可以使莴苣、蚕豆、萝卜和土豆等增产。油菜甾醇内酯对桦、榆等树苗不仅促进茎生长，还能使叶和侧芽数增加。另外它还可以增强农作物抗寒、抗病、抗盐和抗杂草能力，增加农作物产量，在低温下降低水稻细胞内离子的外渗，表明其对细胞膜有保护作用，能提高作物耐冷性。20多年的研究表明，油菜甾醇内酯还存在于其它植物中，如未成熟的白菜种子、绿茶叶和栗树虫瘿等等，同时在这些植物中还分离到其类似物，一般说来油菜甾体在花粉和未成熟的种子中含量最高。自油菜甾醇内酯发现以来已有非常多的类似物从植物中分离和鉴定，而且还有相当多的类似物被有机化学家们合成出来，它们都有相似（或更高或较低）的生理活性，这一类具有甾体骨架的物质统称为油菜甾体（brassinosteroids）。到目前为止，人们从植物中至少已分离到40余种天然油菜甾醇内酯类化合物，对这些结构及其活性的研究表明活性与四个因素有相关性：（）2,3及22R,23R两对羟基；（2）B环的6酮或7内酯；（3）24号位为S构型；（4）A/B环为反式稠环。目前已经发现的有利用价值而且容易人工合成的主要有28-高油菜甾醇内酯（活性与油菜甾醇内酯几乎相当）和24-表油菜甾醇内酯（活性相当于天然油菜甾醇内酯的十分之一，但由于合成相对简单它仍然是目前使用最为广泛的品种之一）（Scheme 2）。同时对人工合成类似物研究后还发现延长边链可能增强活性，例如25-甲基油菜甾醇内酯（Scheme 2）具有比油菜甾醇内酯更高的活性。目前在本研究领域中还有许多天然的油菜甾醇内酯类或非油菜甾醇内酯类但有相同（相近）效果的化合物被分离、鉴定和合成，人工合成的同类化合物也有许多被应用于农业生产。（三）相关技术领域国内外发展现状、趋势目前人们得到油菜甾醇内酯或其类似物有两种方法：从天然产物中提取或人工合成。1提取法（1）从蜂蜡中提取油菜甾醇内酯的方法由于蜜蜂经常在花粉中采集蜂蜜，所以在蜂蜡中有微量油菜甾醇内酯，详细资料可以参见专利CN85102899。（2）以油料加工废料为主要原料提取天然油菜甾醇内酯浙江皇嘉生化有限公司利用西南师范大学黄志桂和赵明婕教授发明的提取天然油菜甾醇内酯的高效萃取法新工艺,并利用油料加工废料,以天然油菜甾醇内酯为主要原料,再辅以其它有效成分,于1996年建立了天然油菜甾醇内酯合剂工业化生产基地。人工合成的油菜甾