Primer-BLAST是NCBI的引物设计和特异性检验工具。Primer-Blast 介绍Primer-BLAST,在线设计用于聚合酶链反应（PCR的特异性寡核苷酸引物。Primer-BLAST 可以直接从 Blast 主页（http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/）找到，或是直接用下面的链接进入：http:/www. ncbi. nlm.n ih.gov/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异 性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好 的引物程序直接用Blast进行引物特异性验 证。并且，Primer-BLAST能设计出 只扩增某一特定剪接变异体基因的引物-an importa nt feature for PCRprotocols measuri ng tissue specific expressi on（注： 没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。 Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比 单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。Primer-BLAST 的输入Primer-BLAST界面包括了 Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个 咅E分：target template（模板区），the primers （引物区），和 specificitycheck （特异性验证区）。跟其它的 BLAST一样，点击底部的“ Advaneed parameters ”有更多的参数设置。模板(Template )在“ PCRTemplate ”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST 就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在 specificity check区选择）是唯一的。Primftf-BLASTfiKSU Primpr-SL fcST: Fjiwlnq piinM* HWCNIC t rh PCR 闺曲阍畔他拿刚 糾訂河 3 邮油 BLASTS.Ttot lorWw jmcWe mwRErt mm 別昨 雀 Ef 就）oy #pc1 cr mPCR grpp馬忖Eitlcr ac-r esriQnf ql. or FASTA lequerife-J -i ! i-M_003362设计引働FfomToFoiward pdmftfRfrwrSjlt fltiinrlTx AOr,FASIA filePrimer P冲帖in住艸徑IH* nty own forwiffl-d primer （53B or plus irtrand）IhJ nry own uitwFMt |utinr （5 ST on mlniK 豪口謂础GGCAACAGGAjCTGAAGAAGCGC CMTGAGAAAiKCAGCTCCproduct100 of pchners lc r ilurnWpcr产IS大/卜10MMlOplHxflJChing tempuEdturh5?060 0630-Max tp diftefence ,、 TmtfEK&iLinlion SolectronAreiseq mKNAsei阳11（吏FC怦:empiaite inpiiis require!: ror oeiohs m me scdofi /Exon juridion sjinJMd prBereniceExdfi junclion maRh74Minttr： nun tr &f bmut anneal to E口ns 諭泊冒 50r 3Side 谊 1W Hnebori wtntron in日曲onintrom lenqlh raneMk100Q1COOOOO引物（Primers ）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在 Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库(在specificitycheck区选择)。根据需要可设置产物的大小，Tm值等。特异性(Specificity )在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这 一步是比较重要的。这里提供了 4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected refere nee assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the sta ndard non-redu ndant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给 出更准确的结果。特别是，当你用 NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体 基因的特异引物。selected refere nee assemblies包括以下的物种：huma n,卩rimer Pjir Specilitfy Chckinri F(si 0$ 旳uhrv述可以聊入$个搠_ -诜择一个数攜庠实例分析用人尿嘧啶 DNA糖基化酶（uracil-DNA glycosylase genes, UNG,GeneID: 7374） 的两个转录本序列作为一个例子来分析。UNG1 勺序列长一点（NM_003362 , UNG2 的序列短一点（NM_080911注：拿这两个基因的序列ClustalW 一 下就可以了）。这里用UNG2勺序列设计引物，选择 RefSeq mRNA database,物种是Human其 它默认。结果如下图A-B所示，设计的引物只能扩增出 UNG2看上面的图，把“ Allow primer to amplify mRNA splice varia nts”这个选项给勾上，出现的 结果如下图-C所示，新的引物也可以扩增出 UNG1（注：我试了一下，不能得到 预期的结果，可能参数没设对）。 tUM Pi MH M片”Ptlt temrletv lUno Jaihiihr WHomo loieos uredlOMA gooayteM (UM)t tramcncA ”ww NCB1 Trantat Refrerxe Seounces (Ofgacwn Imwted to Homo(x9m) tUM Pi MH M片” tUM Pi MH M片” Sufnrnary of iMfrl DtWbd pfimx 2poSsaai4mi 检”I电LentbSuetSwp TmGO.Fo4|m2GCCAGAAGACGCTCTACTCCPlut207897196000%(UvwdfAGOTGAAGACTTGGTOTGGGs34794G0 SOQO600%Piewct kiitb 402PietkKB InmM4 訶r、L丄 HOfw UfMrn urtc&NA glyrgj (UNG), tramcri e ciaec 1AGTGAAfiACTmtHVKM 20BTetrUta3)GCCTTGTnTCTTGCTCTGG mCACCATAAAGGCAGGG 499SWMd l4te 5 Sun Slop T GCSX 813 8S 5999 5000*Mm3D 1311 1292 5993 4500%PK X dU Homos“0NA glycoilAM (UNG) tfMiscnpf 心2. mRNApto4vet itaoth 4WFosMrd ptXBex 1fiCu flvl i i iz 1IXxTIVrG6T“u 20 31Rrvre pnaet 1 TfUS1311TTTCACCArAAAMCJLJUXW 2C imPieAidt mbtictiH vfkMiK中？ Homo .IM uracOKA GycgyUi* (UNG) nuclew t*rw tnco*n|pfewi. Wwitcopt 僧riMrt 1. mRl4Anwd pciMt i cinurrrivnu. it rue ao TeepUMMl K0pc&aes iTwUM13WTTTCMCATOAGOCJUUMO 2 1SOFigure. Primer-BLAST results for UNG transcript variant 2. The NCBIReference seque