选彳3现代生物科技专题知识点总结基因工程基因工程的概念概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基本原理:让目的基因在受体细胞内稳定且高效的表达理论基础：DNA是生物遗传物质的发现,DNA双螺旋结构，遗传信息传递方式 核心:构建重组 DN册子(一 )1如工程的基本工具1. ”分子手术刀”一一限制性核酸内切酶(限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)功能：能够 识别双链DNA分子的某种 特定的核甘酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核甘酸之间的磷酸二酯键 断开,因此具有专一性。(3) 结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。注意：用同种限制酶分别切割目的基因和载体从而形成相同的粘性末端,然后用DNA!接酶将目的基因和载体连接起来，有时用不同限制酶也可以形成相同的粘性末端，用两种限制酶切割使目的基因和载体两端各形成两种粘性末端，防止载体和目的基因自身环化2. ”分子缝合针” 一一DNA1接酶(1)两种DNA1接酶(E - coliDNA连接酶和T,-DNA1接酶)的比较：相同点：都缝合 磷酸二酯键。区别：E - coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T,DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。3. )与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核甘酸加到已有的核甘酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA1接酶是连接两个 DNA段的末端，形成磷酸二酯键。DNAI接酶DNA聚合酶小同点连接的DNA一双链单链模板不要模板要模板连接的对象2个DNM段单个脱氧核甘酸加到已存在的单链DNA段上相同点作用实质形成磷酸二酯键化学本质蛋白质3. ”分子运输车”一一载体(1)载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源DNA段插入。具有标记基因，供重组DNA勺鉴定和选择。(2)最常用的载体是 质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA子。(3)其它载体：入噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第#页共10页第一步：目的基因的获取1 .目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。2 .原核基因采取 直接分离获得，真核基因是 人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。3 .PCR技术扩增目的基因(1) PCR勺含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。(2)目的：获取大量的目的基因(3)原理：DNAZ链复制(4)过程：第一步：加热至 9095CDNAB链为单链，断裂氢键；第二步：冷却到 5560 C,引物与两条单链 DNA吉合，形成局部双链 DNA第三步：加热至 7075C,热稳定DN咪合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。(5)特点：指数(2n)形式扩增(6)使用的前提：已知目的基因的一段核甘酸序列第二步：基因表达载体的构建 (核心)1 .目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2 .组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因(1)启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNAM合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA最终获得所需的蛋白质。(2)终止子：也是一段有特殊结构的DNM段，位于基因的尾端。(3)标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。注意：载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体,又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接,两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 第三步：将目的基因导入受体细胞 _1 .转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2 .常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法(农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA)其次还有 基因枪法 和 花粉管通道法 等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。方法的受体细胞多是受精卵。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是 大肠杆菌，其转化方法是：先用 Ca2+处理细胞，使其成为 感受态细胞，再将重组表达载体 DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DN酚子，完成转化过程。3 .重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达1 .首先要检测转基因生物的染色体DNA是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交(DNA-DNA肢术。第2页共10页2 .其次还要检测目的基因是否转录出 mRNA方法是采用分子杂交（DNA-RNA菽术。3 .最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原一抗体杂交 技术。4 .有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如生物抗虫或抗病的鉴定等。（三）基因工程的应用1 .植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2 .动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物（重点：乳腺生物反应器看课本）。3 .基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。4 .基因诊断：又称为 DN阳断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。（四）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和 生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）蛋白质工程 DMA合成 ,分子成什 吊而加刊&首基因.EH -? 丁基啊 I士二式且恩 Si出I转再谢后一多肽攘I播繇I三维结狗生物功能中心法则蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核甘酸序列（基因）蛋白质工程与基因工程区别备白质工程基因工程实质通过改造基因，以定向改造天然蛋白 质，甚至创造自然界不存在的蛋白质将目的基因从供体转移到受障细 胞，并在受体细胞中表达结果合成自然界丕在在的蛋白质只能生产自然界已正在的蛋白质联系备白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代基因工程专题2 细胞工程（一）植物细胞工程1 .理论基础（原理）：细胞全能性全能性概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物个体的潜能，也就是说，每个生物细胞都具有全能性的特点。 现实表现：在生物的生长发育过程中，细胞并不会表现出全能性，而是分化成各种组织和器官原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有选择性地表达出各种蛋白质，分化形成不同的细胞，从而构成生物体的不同组织和器官。 全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞2 .植物组织培养技术 (1)原理：植物细胞的全能性(2)过程：离体的植物器官、组织或细胞一-愈伤组织一-试管苗一-植物体脱分化和再分化(3)植物组织培养条件:离体的植物细胞、组织、器官无菌和人工控制培养在人工制备的培养基上给予适宜的培养条件(4)用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产(具体的应用看课本38页)。1 5)地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。3、植物体细胞杂交技术概念：不同种植物的体细胞融合成一个杂种细胞，杂种细胞发育成新的植物体的方法理论基础：细胞膜的流动性和植物细胞的全能性过程：见课本过程注意：去掉细胞壁的方法：酶解法(纤维素酶和果胶酶)原生质体融合的方法：诱导融合：物理法(离心、振动、电激)化学法(PEG,聚乙二醇)意义：因为不同种生物之间存在生殖隔离，此项技术在克服不同生物远缘杂交的障碍上，取得了巨大的突破。(二)动物细胞工程2 .动物细胞培养(1)概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。(2)动物细胞培养的流程：取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)一剪碎一用胰蛋白酶或胶原蛋白酶 处理分散成单个细胞一制成细胞悬液一转入培养瓶中进行原代培养一贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。(3)细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁。细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。(4)动物细胞培养需要满足以下条件无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自 身造成危害。营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。温度：适宜温度：哺乳动物多是 36.5 C+ 0.5 C; pH: 7.27.4。气体环境：95溢气+ 5%CO Q是细胞代谢所必需的，CO的主要作用是维持培养液的pH。(5)动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。3 .动物体细胞核移植技术和克隆动物(1)哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植(比较容易)和体细胞核移植(比较难)。(2)选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；含有促使体细胞细胞核表现全能性的物质和营养(3)体细胞核移植的大致过程是：(右图)遇择 供体母牛 受体母牛I I-同胡发情处理I知缝排卵I分换脸修IA的稚华，保护濒危物种，增大存活数量； 作为异种移植的供体；，妊*L.出虫胚胎移植 丁，绊羊.上利(4)体细胞核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；生产珍贵的医用蛋白；用于组织器官的移植等。1 5)体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。3 .动物细胞融合(1)动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。(2)动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。(3)动物细胞