方法对比 讲稿用2.1 结晶法 溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶 液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌 酶晶体最为传统的方法之一。该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋 清中加入（NH4）2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶 液的pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4C放置大概2周，即可析出大部分的 溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将 析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。结 晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求 溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。此外，晶体的形 成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程 中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制） 所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。为进 一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。 相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、 尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。2.2 离子交换法 离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具 有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。依据原料及分离纯化的不 同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。 离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产, 是目前溶菌酶生产的常用方法。（联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括 膜亲和层析法、离子交换层析法等。尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便 开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。此方法操作简便、成本低、高效、可实现自 动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。）2.3 色谱法 以亲和力为基础，将不溶性的载体与可逆结合的配体相偶联，制备成具有特异亲 和性的分离介质，选择性地吸附生物活性物质，依据待分离物质的特性再利用相 应组成的溶液洗脱而达到分离提取需要物质的目的，这就是 20 世纪 80 年代末 发展起来的亲和色谱技术。亲和色谱技术是诸多色谱法的一种 选择性高 快速、 高效，适合蛋清溶菌酶高效分离与纯化的需要。随着生产对技术要求的提高，研 发人员以传统的膜处理为基础，利用固定离子亲和色谱和膜分离相结合，制备固 定金属亲和膜，因其具有良好的分离性能，可用于蛋白质的分离纯化。多方研究 结果表明固定金属亲和膜对溶菌酶的选择吸附性能良好。如若将间歇式吸附与连 续式脱附耦合亲和层析法相结合，用于溶菌酶分离纯化，蛋白质回收率和吸附剂 利用率都会有明显提高。2.4 亲和分离法 亲和力为基础，借助物质间的特异性结合力，使目的物质或者杂质与相应的配基 结合而达到分离纯化目的物的目的，即亲和分离法，包括亲和沉淀法、亲和膜分 离法、亲和过滤法、亲和层析法等。尤以亲和层析法和亲和沉淀法的应用广泛。 亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具 有的专一性亲和力而设计的色谱技术。而亲和沉淀法既具有相当于亲和层析法的 纯化效率，又克服了亲和层析法难以放大的缺点，是蛋白质等生物大分子的新型 亲和技术之一。溶菌酶用途广泛，其分离纯化工艺技术的研究一直是人们关注的热点。溶菌酶的 分离纯化技术多种多样，应依据原料的来源以及产品的要求而选择合适的分离纯 化方法，以达到优质高产的效果。例如，用结晶法生产溶菌酶时容易发生共晶问 题；虽然亲和分离技术不存在共晶问题，但只能处理小量原材料，并且各种昂贵 的亲和柱介质也会导致较高的生成成本。而色谱技术因其选择性好、分离速度快、 效率高，尤其是过程容易实现自动化控制，因而成为溶菌酶研发技术研究的重点。 尽管如此，单一分离纯化方法存在纯度和回收率低下的缺陷，因而依照一定顺序 采用建立连续式的分离体系分离纯化溶菌酶可以满足大规模生产的需求。例如， 研发人员可以充分利用溶菌酶耐温耐酸、稳定性好、溶解性强的特性，将色谱分 离法、沉淀法、结晶法等联合使用，定能有效地改进溶菌酶的分离纯化。另外， 鉴于膜分离技术具有操作条件温和且无相变化，基本不会破坏原料中的生物活性 物质，因而由亲和层析与膜分离技术结合的亲和超滤等技术都将是溶菌酶分离纯 化新型技术，有待进一步发展。盐析原理高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的盐离子，它们能中和生物分子 表面的电荷，使之得以稳定的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层；另外， 大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方面压缩了水化层的浓 度降低了它的亲水性，从而沉淀析出。盐析沉淀法不仅是蛋白质初级纯化的常用手段，在某些情况下还可以用于蛋白 质的高度纯化，但是利用盐析沉淀得到的目标产物中含盐量较高，一般盐析在沉 淀后，需要进行脱盐处理，才能进行后续的分离操作。与盐析相比，等电点沉淀 的优点是无需后续的脱盐操作。但是，如果沉淀操作的pH值过低，容易引起目 标蛋白质的变性。直接提取法是依据溶菌酶的理化性质，利用溶菌酶和杂蛋白等电点的差异， 通过调节 pH 值来沉淀蛋白，达到分离溶菌酶的目的。超滤法 是根据膜孔径的大小，在压力的驱动下将分子大小不一的溶质分离，从而获得目 标物。离子交换原理 离子交换剂与溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者 借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行，离子交 换剂由基质、电荷基团或功能基团和反离子构成。粗放大概就是不需要多么高深技艺的，增加投资、扩大厂房、增加劳动投入，来 增加产量。集约型也是现在提倡的，在生产规模不变的基础上，采用新技术、新工艺，改进 机器设备、加大科技含量的方式来增加产量反胶束法2. 1 溶菌酶的提取鸡蛋清中溶菌酶的等电点11. 1,相对分子质量14 300,质量分数约占鸡蛋清总量的3%4%。在鸡蛋清 中，溶菌酶与其他蛋白质的等电点差别较大，所以在提取缓冲液pH 9. 0的条件 下,只有包括溶菌酶在内的个别蛋白质带有正性电荷,很容易将其与大量带负性 电荷的蛋白质分开。利用pH 9. 0的Tris-HCl缓冲液抽提鸡蛋清，通过离心法除 去不溶物，获得溶菌酶的粗提液。小心破碎鸡蛋有气室的一头，使蛋清缓慢流出 并收集到一个干净的250 mL烧杯中，用双层纱布过滤鸡蛋清，收集滤液，每10 mL 滤液中加入pH 9. 0的Tris-HCl缓冲液20 mL，轻轻摇晃混合均匀，在冰箱冷藏 室中静置20 min，转入离心管中，在转速4 000 r *min 1的条件下离心15 min， 得到的上层清澈溶液即为溶菌酶粗提取液。2. 2 标准曲线制作及粗酶液的含量测定将溶菌酶晶体用0. 1 mol - L 1氯化钾溶液(pH 11)配制成0. 1，0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0gL 1的溶液，以稀释液为空白对照，经全波长扫描可知溶 菌酶在280 nm处有最大吸收峰，确定在该波长测量吸光度A。以A为纵坐标，溶 菌酶质量浓度为横坐标，得回归方程Y = 0. 676 7X + 0. 015 5( r = 0. 982 9)。将溶菌酶粗提取液稀释100倍，测定其在280 nm处的A 0. 266，根据回归方程 计算溶菌酶质量浓度0. 370 g - L 1。根据溶菌酶粗提取液中溶菌酶的含量， 将溶菌酶粗提取液用不同质量分数KCl稀释液稀释37倍，即得1. 0 gL 1 溶菌酶溶液。2. 3 溶菌酶的提取将溶菌酶粗提取液与不同配比的反胶束溶液以一定体积比例 进行混匀，在旋涡振荡混合器上充分混合5 min，使萃取过程达到平衡，将乳浊 液倒入离心管中，于3 000 r min 1离心4 min，取下相液，测定其在280 nm处的A,根据回归方程计算溶菌酶的含量。离子交换层析1 2. 1 蛋白的盐析粗分离取新鲜鸡蛋，用双层灭菌纱布过滤得到水样成分， 充分搅拌30 min（ 搅拌剧烈程度以不起泡沫为准） 。为了降低蛋清粘度以利后续 实验，取5mL蛋清用pH 9. 0的0. 05 molL - 1 Tris-HCl缓冲液进行5倍稀 释，4C下静置至少6 h。静置稀释后的蛋清溶液在4C, 10 000 rmin - 1离 心10 min,上清中加入硫酸铵粉末使饱和度达到50%,磁力搅拌使溶解，4C静置 过夜，于4C, 12 000 r min 1离心10 min。取上清，加入硫酸铵粉末，使 其饱和度达到80% 7，操作同50%饱和度硫酸铵，所得沉淀用pH 9. 0的0. 05mol L 1 Tris-HCl缓冲液溶解，并于4C 0. 05 mol L 1 Tris-HCl 缓冲液中透析，期间换透析液24次，透析过夜。1 2 2 蛋白质检测蛋白质含量参照Bradford法测定8，9。用BSA蛋白标准液在595 nm波长测 得的吸光值绘制标准曲线。不同饱和度盐析得到的蛋白样品在595 nm 波长测得 的吸光值通过标准曲线计算含量并换算成质量。1 2. 3 离子交换层析分离溶菌酶1 2. 3. 1 层析所需缓冲液Tris-HCl缓冲液（THB） : 0. 01 mol L 1 Tris-HCl缓冲液：1. 211 4 g Tris-Base，溶于蒸馏水中，在900 mL时调节pH，溶液平衡到室温时定容到1 000 mL，pH 9. 0。溶液需用0. 45 “m滤膜过滤后在超声仪中脱气30 min。1 2. 3. 2 层析条件AKTA explorer 900层析系统：装入HiTrapQ FF预装柱，上样前用pH 9. 0的 0. 01 molL 1Tris-HCl缓冲液（THB）平衡层析柱，直到流洗液经AKTA检 测各项指标回归基线。上样后用缓冲液进行洗脱；洗脱条件：用pH 9. 0，0. 01 mol L 1 Tris-HCl缓冲液，流速1 mL min 1进行洗脱。1 2. 3 蛋白质纯度测定收集各层析峰，检测蛋白浓度,纯度分析采用SDS-PAGE电泳法，制板采用Laemmli 体系，即12 gdL 1的分离胶和5 gdL 1的浓缩胶。采用考马斯亮蓝法 染色。1 2. 5 溶菌酶酶活测定采用舒加法测溶菌酶酶活10， 11，溶壁微球菌干粉复苏后，进行二次传代培 养，富集得到50 mL菌液，4C, 3 000 r min 1离心15 min,去上清后，沉 淀用生理盐水重悬，重复此操作3 次。最后用生理盐水重悬菌体，加入甘油混匀， 分装成小管保存在一20 C，备用。Ps:蛋清溶菌酶的活性测定 根据研发需要，有关测定溶菌酶活性的方法主要有比浊法、紫外分光光度法、琼 脂板扩散法、比色测定法和高效液相色谱法等。使用琼脂板扩散法测定蛋清溶菌 酶活性时，在琼脂平板上涂有试验菌，之上放上滴有一定量的溶菌酶样品的圆形 小纸片，借助浓度产生的推动力使蛋清溶菌酶样品在平板上扩散，产生一定大小 的抑菌圈，根据抑菌圈的大小，以标 准样品为参照，通过比较，便可以定量地测出蛋清溶菌酶的活性。使用琼脂板扩 散法测定蛋清溶菌酶活性时，可将微球菌和艳红染料按1：1进行混合，同时加入 适量的NaOH (1.30mol/L)，搅拌放置一定时间，确保艳红染料充分渗入到细胞 壁内后，再洗去多余的染料，最后通过颜色的深浅可以判断裂解的程度，定量测 量溶菌酶活性。因分离目的及分离过程的差异，上述各种方法都或多或少存在一 定的缺点。例如，比色法虽然操作简单，但容易产生较大的误差；比浊法因容易 受外界干扰，重复性差，若用于测定单个样品，则效果较好。近年来，