实验五 细菌鉴定中常见的生理生化反应一、实验目的。1) 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。2) 了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。3) 了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。二、实验原理。各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。1. 糖（醇）类发酵试验不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。指示剂溴甲酚紫，pH5.2黄色pH6.8紫色，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。2. 甲基红试验（M.R试验）甲基红试验，pH4.4红色pH6.2黄色，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下。有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。3. Voges-Proskauer试验（伏-普试验，V.P. 试验）伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为V.P.反应阳性。4. 靛基质试验某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质。5. 硫化氢试验某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。6. 明胶液化实验明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25度以上时明胶就会液化。有些微生物可产生一种成为明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4度仍能保持液化状态。7. 柠檬酸盐利用试验有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂pH6.0(黄)7.6(蓝)，由绿色变为深蓝色。8. 淀粉水解实验细菌水解淀粉的过程可以通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。三、实验仪器、材料和用具请预览后下载！实验仪器：32度恒温培养箱、4度冰箱；微生物材料：大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌、待鉴定的未知菌的平板单菌落；试剂：甲基红试剂、V.P.试剂、吲哚试剂，KOH溶液；实验用具：试管：每个试验3根试验管，1根对照管，8个试验，共32管；杜氏小管、接种环、接种针、酒精灯、火柴、试管架、记号笔。四、实验步骤。1. 配制培养基（上次实验完成）2. 鉴别实验1）糖(醇)类发酵试验编号：在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。接种：取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。将已接种好的培养基置32温箱中培养24h。2）. 甲基红试验(M.R.试验)将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，32培养 24h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。3）. 伏一普试验(VP试验)将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，32培养24h，取出，加入40KOH 7滴，然后再加入等量的5a-萘酚溶液，用力振荡，再放入37温箱中保温30min，以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏普反应阳性。4)靛基质(吲哚)试验 将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，32培养24h后，滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，轻轻摇动，观察结果。 出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。5). 硫化氢试验：将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，32培养24h，观察结果，若有黑色出现者为阳性。6)明胶液化试验 取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置32培养24小时。故观察结果时，应将明胶培养基轻轻放入4冰箱30min，此时明胶又凝固。若放置于冰箱30min仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。7） 柠檬酸盐利用试验取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，32培养24h后，观察结果。培养基变深蓝色者为阳性。8） 淀粉水解试验在培养进表面滴加碘液，观察是否变紫。五、实验结果及分析1.观察结果如下表：表1 实验结果请预览后下载！编号大肠杆菌枯草杆菌产气杆菌变形杆菌未知菌空白对照葡萄糖发酵实验变黄色，有气泡/变黄色，无气泡变黄色，无气泡紫色，无气泡乳糖发酵实验变黄色，有气泡/紫色，无气泡紫色，无气泡紫色，无气泡甲基红试验红色/黄色/桔红色淡黄色伏-普试验黄色红色红色淡黄色吲哚试验玫瑰红色/玫瑰红色/无色淡黄色硫化氢试验黄色/黑色从中间向外蔓延黄色黄色明胶液化试验无液体/无液体/液体无液体柠檬酸盐利用试验下蓝上黄/下黄上蓝/下蓝上黄绿色淀粉试验紫色紫色紫色黄色紫色紫色表2. 各项生理生化实验现象及意义阳性阴性（对照）现象意义现象意义葡萄糖发酵实验溶液变黄细菌代谢产有机酸溶液仍为紫色细菌代谢不产酸杜氏小管中有气体（体积10% ）细菌代谢产生气体杜氏小管中无气体细菌代谢不产生气体乳糖发酵实验溶液变黄细菌代谢产有机酸溶液仍为紫色细菌代谢不产酸杜氏小管中有气体（体积10% ）细菌代谢产生气体杜氏小管中无气体细菌代谢不产生气体甲基红试验加入甲基红，培养基呈现红色pH下降到4.2以下加入甲基红，培养基为黄色pH值大于6伏-普试验培养基呈现红色细菌代谢产生乙酰基甲醇培养基为黄色细菌代谢不产生乙酰基甲醇吲哚试验培养基呈现红色细菌代谢可分解色氨酸培养基为黄色细菌代谢不能分解色氨酸硫化氢试验产生黑色固体细菌代谢产生硫化氢无黑色固体产生细菌代谢不产生硫化氢明胶液化试验明胶在4仍能保持液化状态细菌可产生明胶酶明胶在25以下不能液化细菌不能产生明胶酶柠檬酸盐利用试验培养基由绿色变为深蓝色细菌可利用柠檬酸盐作为碳源培养基仍为绿色细菌不能利用柠檬酸盐作为碳源淀粉水解试验不变，黄色细菌可利用淀粉变紫细胞无法利用淀粉请预览后下载！2.照片及分析：1）糖(醇)类发酵试验现象：葡萄糖发酵中，三个菌种的溶液都变黄，为阳性；仅大肠杆菌杜氏小管含气泡。分析：大肠杆菌能分解葡萄糖，产生甲酸等产物，并有甲酸解氢酶，可将其分解为CO2和H2，故生化反应结果为产酸产气。而另外两种菌代谢产生了酸，但没有气体产生。另外，未知菌溶液临近表面处有一层深色区域，不像指示剂的颜色，可能为某种代谢产物。图1 葡萄糖发酵（从左到右依次为对照、大肠杆菌、未知菌、变形杆菌）现象：乳糖发酵中，未知菌和变形杆菌都不变色，大肠杆菌的培养液变黄。只有大肠杆菌杜氏小管有气泡。分析：变形杆菌无法利用乳糖，未知菌无法利用乳糖或在乳糖代谢途径中没有产生有机酸，大肠杆菌乳糖代谢途径产生了有机酸，且产生了气体图2 乳糖发酵（从左到右依次为对照、未知菌、变形杆菌、大肠杆菌）2）. 甲基红试验(M.R.试验)现象：甲基红试验中，大肠杆菌为深红色，说明其产生的酸最多；未知菌为桔红色，说明它产酸量中等；产气杆菌为黄色，说明它基本不产酸。分析：大肠杆菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸等，使培养基的pH降低，培养基呈现红色。产气杆菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，使pH升至大约6，培养基呈现黄色。图3 甲基红试验（从左到右依次为对照、大肠杆菌、产气杆菌、未知菌）请预览后下载！3）. 伏一普试验(VP试验)现象：大肠杆菌黄色（即无变化），产气杆菌稍有红色，未知菌为红色。分析：，说明大肠杆菌在葡萄糖蛋白胨水中代谢不产生乙酰基甲醇；产气杆菌产生了少量乙酰基甲醇；未知菌产生了较多乙酰基甲醇注：V.P.试验一开始是没有现象的，最后把其他的试管都洗了后(这也是没有对照的原因)，我们重新滴加了边台的NaOH，然后用a-萘酚溶液处理，所以估计一开始没有现象的原因可能和KOH失效有关。图4 V.P试验（从左到右依次是大肠杆菌、产气杆菌、未知菌）4)靛基质(吲哚)试验现象：吲哚试验中，未知菌没有变化；产气杆菌和大肠杆菌溶液表面产生了少量玫瑰红。分析：未知菌无法分解色氨酸，产气杆菌和大肠杆菌可以分解色氨酸。另外，对照组也出现了玫瑰红，照理说里面没有微生物分解蛋白胨中的色氨酸产生靛基质的话，是不会反应产生红色化合物的，估计试剂有污染，比如有含色氨酸酶的杂菌引入。图5 吲哚试验（从左到右依次是对照、未知菌、产气杆菌、大肠杆菌）5). 硫化氢试验：图片不是很清晰，请见谅。现象：硫化氢试验中，仅有变形杆菌产生了黑色物质。三只试管接种周围都有向外扩展现象。分析：仅变形杆菌能分解含硫的氨基酸并产生硫化氢。三种菌均具有运动能力图6 硫化氢试验（从左到右依次是对照、未知菌、变形杆菌、大肠杆菌）请预览后下载！6). 明胶液化试验现象：明胶液化试验中，仅有未知菌使明胶在25以下液化分析：仅未知菌可产生明胶酶图7 明胶液化试验（从左到右依次是对照、未知菌、大肠杆菌、枯草杆菌）7). 柠檬酸盐利用试验现象：柠檬酸盐利用实验中，未知菌和大肠杆菌使培养基变黄；产气杆菌培养基变蓝。分析：未知菌和大肠杆菌不能利用柠檬酸钠作碳源或在利用柠檬酸盐时产生了酸，产气杆菌在利用柠檬酸盐时产生了碱图8 柠檬酸盐利用实验（从左到右依次是对照、未知菌、产气杆菌、大肠杆菌）8). 淀粉水解试验变形杆菌空白对照未知菌枯草杆菌产气杆菌大肠杆菌图9 淀粉水解实验请预览后下载！现象：淀粉水解实验中，除了未知菌外，所有菌均有变蓝的现象。分析：未知菌分解了淀粉，其他菌无法分解或只能少量利用淀粉。六、实验小结这次实验重点是观察，而且要注意观察前的操作，比如明胶要观察必须先在4冰箱冷藏，拿出来后要尽快观察防止其在室温下融化；而吲哚试验要注意不要晃动，因为产生的玫瑰色靛基质本来就不多，如果剧烈晃动使之扩散开来的话，就基本上看不见了；V.P.试验是最纠结的，很多组在32下放了很久还是没有现象，我们开始认为是因为温度不够，可是加热也没有效果，于是考虑是不是试剂的问题，于是擅自用了实验室边台用于调pH的NaOH溶液，结果果然变红了。七、思考1. 接种后的明胶试管可以在37度培养，在培养后你