分类号：2011 届本科生毕业论文题目：乳酸中嗜热链球菌的分离及鉴定TitleLactic acid streptococcus thermophilus cultured in theseparation and identification系别 专业 学生姓名 学号 指导老师 职称化学与生命科学学院07级生物技术2007090223郭志华 讲师2011年 4 月 17 号摘要目的从乳酸中将嗜热链球菌分离出并进行鉴定。方法利用MRS培养基 将乳酸中的菌种培养，经过革兰氏染色、镜检分离出嗜热链球菌，最后选出 7 株，对它进行菌落形态的观察。最后对其进行各种理化鉴定。 结果镜检结果该 菌为革兰氏阳性，经过生化鉴定该菌为嗜热链球菌。关键词：乳酸；嗜热链球菌；分离；鉴定。ABSTRACTobjective the streptococcus thermophilus cultured from lactic acid will isolate and evaluations. method Use the media will lactic acid bacteria MRS cultivation, and after grams staining, isolated anti-bma streptococcus thermophilus cultured, finally chosen for it, seven strains colony morphology observation. Finally the various physical and chemical identification. result microscopy results this for gram-positive bacteria, after biochemical identified the bacteria for streptococcus thermophilus cultured.Keywords: lactic acid; Streptococcus thermophilus cultured; Depart; appraisal目录绪论51 试验材料与方法 61.1 试验材料 61.2 实验试剂 61.3 实验方法 61.3.1 乳酸菌的筛选 61.3.2 乳酸菌的分离纯化 61.4 理化性质的测定 72 结果与讨论82.1 菌落形态和细胞形态 82.2 生化试验结果 113 小结 12参考文献 13致 谢14绪论乳酸菌是一类能利用可发酵的糖产生大量乳酸的细菌通称。这类细菌广泛分 布在土壤、植物根茎、湖泊及动物的体内。酸菌从形态上可以分为球菌和杆菌， 并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性或厌氧性 细菌。目前，对乳酸菌的应用研究，着重于发酵乳制品、发酵食品和医药工业等人 类生活密切相关的领域。乳酸是以新鲜牛乳经有效杀菌，用不同乳酸菌发酵剂制 成的乳制品。由于该产品营养价值较高，并能改善肠道正常微生物区系的稳定， 因此它已成为深受消费者青睐的营养保健食品。在我国市场上，生产销售的各种乳酸制品中，作为发酵剂使用的乳酸菌，通 常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。乳酸的生产是利用原始菌种进行逐级扩大培 养方式进行，即活化复壮再进行扩大培养至乳酸菌的活力都达到可用程度 后，投入生产进行发酵。在发酵剂的活化过程中，工序多，技术要求严格，稍有 不甚就会污染杂菌，通过对乳酸发酵剂嗜热链球菌的分离和鉴定能及时掌握研究 进程和生产控制。1 实验材料和方法1.1 材料和仪器乳酸：采购于超市 伊利；化学试剂：均为国产分析纯。超净工作台、酒精 灯、接种环、灭菌锅等。1.2 实验试剂MRS固体培养基：蛋白胨10 g,肉膏10 g，酵母提取物5 g,柠檬酸二铵2 g,乙酸钠 5 g , KHPO42 g, MnSO4.4H2O 0.25 g, MgSO4.7H2O 0.58g,葡萄 糖 20g,吐温 80 1ml,琼脂 25g,水 1000m。调 PH6.26.4, 121 C灭菌 15minPY基础培养基:蛋白胨0.5 g,酵母提取物1.0 g,盐溶液4.0 g,蒸馏水100ml。 调PH值6.0左右，113C灭菌20min。蛋白胨水培养基：蛋白胨5g, Nacl2.5 g,蒸馏水500ml。调ph值7.0左右， 121C 灭菌 20min。葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5g,葡萄糖5g, KHPO4 2g,蒸馏水1000ml, 调 PH 值 7.072 过滤，121 C灭菌 30min。明胶基础培养基：蛋白胨1.0 g,酵母提取物1.0 g,葡萄糖0.1g,明胶12.0g, 盐溶液 4.0ml，蒸馏水 100ml, ph 值 7.0,113C115C灭菌 1520min。可溶性淀粉培养基：向PY培养基中加入0.5%可溶性淀粉。1.3 实验方法1.3.1 乳酸菌的筛选将乳酸均匀涂布于MRS培养基平板上，37C静置培养48h。1.3.2 乳酸菌的分离纯化挑取培养基上的菌落,划线分离纯化23次,最后选择单菌落,经过镜检确认为纯种，得到7株菌株，4C斜面保存。将菌落平板和细胞形态在显微镜下用 照相机照出。1.4 理化性质的测定1.4.1 KOH 试验用灭菌的接种环加12环5%的KOH溶液于干净的载玻片上，调菌于溶液中， 用环将其混合搅匀，短时间内 KOH 试剂阳性菌会越搅越稠，抬起接种环会产生拉 丝现象，而KOH阴性菌则无拉丝现象。1.4.2 过氧化氢酶测定用灭菌的接种环加12环10%过氧化氢溶液于干净的载玻片上，挑菌于溶液 中，搅拌均匀。观察产气泡情况，有气泡产生，则判断为过氧化氢酶阳性反应。1.4.3 需氧试验将分离纯化后的各菌株分别接种于高层MRS液体培养基中，37C静置培养 2d 后，观察生长情况。1.4.4 淀粉水解试验将各菌株分别接种到可溶性淀粉培养基中，37C培养12天。然后向培养液 中加入 34 滴卢戈氏碘液，如不显色表示淀粉水解阳性反应，显蓝黑色或蓝紫色 时，表示淀粉水解或水解不完全，为阴性反应。1.4.5 明胶液化试验菌株接种后适温培养，观察结果时需经低温处理。如对照管（未接种） 凝固而接种管液化则为阳性反应，同时凝固或者液化为阴性反应。1.4.6 吲哚试验向培养2d后的含菌蛋白胨水培养基内加34滴乙醚，摇动数次，静置lmin、3min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之 间产生红色环状物为阳性反应，否则为阴性反应。1.4.7 V-P 试验将各菌株接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37C培养2d后，向培养物内 加入510滴40%的KOH，然后加入等量的5% a-萘酚溶液，用力振荡，再放入 37C温箱中保温15min30min，以加快反应速度。若培养物成红色，则为V-P反 应阳性。1.4.8 产葡聚糖测试将菌株接种于加有10%蔗糖的MRS斜面培养基上，适温培养24d,如斜面培 养物形成粘稠状菌苔，表明产生葡聚糖，为阳性反应，否则为阴性反应。1.4.9 碳水化合物产酸试验采用PY基础培养基，在其中加入碳水化合物，终浓度达到1%,管内培养基 高度约45cm。灭菌后接入菌株各1环，37C培养2d。取未加入碳水化合物的培 养基作为对照，结晶紫试剂比较颜色的变化记录产酸的强弱。2 结果与讨论2.1 菌落形态和细胞分离到的 7株菌，菌落乳白色、灰色或略显黄色；大而平坦或小而厚，菌落 湿润且大及边缘整齐。镜检细胞形态、大小、排列方式及革兰氏鉴定结果见表一表一 7 株菌的形态特征及大小Table 1 7 strains bacteria the morphological characteristics and size编号染色大小/um形态排列方式1G+1.0*(1.0-1.5)椭球单个或呈短链2G+1.0*(1.0-1.3)椭球单个或成对或呈短链3G+1.0*(1.0-1.4)椭球单个或呈短链4G+1.0*(1.0-1.3)椭球单个或呈短链5G+1.0*(1.0-1.4)椭球单个或呈短链6G+1.0*(1.0-1.5)椭球单个或呈短链7G+1.0*(1.0-1.5)椭球单个或成对或呈短链从表一看出，从酸奶中分离出的 7株 为嗜热链球菌 符合乳酸菌的特性。下 面附平板和细胞的照片0令嗜热链球菌的细胞形态Streptococcus thermophiluscultured cell type嗜热链球菌的菌落形态Streptococcus thermophilus cultured colony morphology2.2 生化试验检测结果对筛选的 7株菌进行进一步的试验鉴定结果见表 2、表3。从表2、表3可见，所有7株菌种都能水解淀粉，KOH试验、接触酶试验、明胶液化试验、吲哚 试验均为阴性，但对于多种糖的利用情况不同。表2 7 株菌株的生化试验结果Table 2 7 strains isolated biochemical test result项目1234567KOH 试验-淀粉水解+接触酶试验-需氧试验好氧好氧兼性厌氧微好氧微好氧微好氧微好氧明胶试验-吲哚试验-V-P 试验+产葡聚糖+注：“+”表示阳性反应：“-”表示阴性反应。表 3 7 株菌的碳水化合物发酵产酸试验结果Table 3 7 strains bacteria carbohydrates ferment produce acid testresults碳水化合物1234567葡萄糖+麦芽糖+乳糖+-+-蔗糖+注：“+”表示阳性反应：“-”表示阴性反应小结市售的乳酸中的乳酸菌多为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌其中球菌较少。采 用常规的革兰氏染色、形态观察的方法对分离到的菌株进行简单鉴定,该方法操 作简单、快速、实验结果可靠。分离到的嗜热乳酸链球菌菌株经活化后可以应用 到生产中。参考文献1 陈晓平，刘华英，魏晓川.自然发酵酸菜汁中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究J. 食品科学.2006(2):91-93.2 杨晓晖， 籍保平， 李博， 等. 泡菜中优良乳酸菌的分离鉴定及其发酵性能的研究 J. 食品科学.2005(5):130-133.3 黄秀梨.微生物学实验