脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期:2012-06-25来源:互联网作者:青岚点击:3644次摘要：细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀 法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染 方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方 法-脂质体转染的原理和操作步骤等。找产品，上生物帮 细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、 脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等,理想的细胞转染方法 是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法- 脂质体转染的原理和操作步骤等。脂质体(lipofectin regeant, LR 试剂是 阳离子脂质体 N-1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA 和 Dioleoyl photidye- thanolamine(DOPE的混合物1:1(w/w。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养 细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法,比它高 5100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时,首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞 适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做:第一，先要固定一个DNA的量和 DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从15g和孵育时间6小时开始， 按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定 出转染时间(224小时。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为 宜。细胞种类:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为 受体细胞。一、脂质体（liposome转染方法原理脂质体（liposome转染方法原理:脂质体（Iiposome作为体内和体外输送载体的 工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进 人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比,有较高 的效率和较好的重复性。中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带 正电的阳离子脂质体,DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动 结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细 胞膜表面,经过内吞被导入细胞。二、脂质体转染操作步骤1、操作步骤方法一：（1细胞培养:取6孔培养板（或用35mm培养皿，向每孔中加入2mL含12x105 个细胞培养液,37C CO2培养至40%60%汇合时（汇合过分，转染后不利筛选细 胞。（2转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量A 液:用不含血清培养基稀释1-10瞄DNA,终量100pL, B液:用不含血清培养基稀释2- 50pgLR,终量100pL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现 象，但并不妨碍转染（如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量。（3转染准备:用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。（4转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37C温箱置624小时，吸除无血 清转染液,换入正常培养液继续培养。(5其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意:转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。2、快速脂质体转染法操作步骤如下方法二:(1以5x105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿培养24小时，使其达到 5060%板底面积。(2在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下： 在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。 旋转1秒钟，再加入脂质体悬液,旋转。 室温下放置510分钟，使DNA结合在脂质体上。(3弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直 接加入1mL DNA/脂质体复合物,37C培养35小时。(4再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养1424小时，(5吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培 养2448小时。(6用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。3、稳定的脂质体转染方法如下：(1接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。(2DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2、(3步骤。(3在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37C培养48小时。（4吸出DMEM ,用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染 克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。三、个人经验：本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细 胞。（别的方法可以参考生产商提供的protocol1、转染前1天将0.52x105细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生 素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达9095%。2、准备复合物（1将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。（2将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中，轻轻浑匀, 室温孵育5分。注意:必须在25分内进行。（3 5分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分。3、吸去培养板的培养基，用PBS或无血清培养基（最好清洗细胞2次。4、将复合物（总体积100ul加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。5、将细胞放入培养箱孵育46h后,可以更换含血清培养液去除复合物（也可不 用。6、2448h后可以观察转入基因表达情况。7、稳定转染:换含血清培养基24h后将细胞以1:10（或更高比例传代，1天后更 换筛选培养基筛选。8、优化:要保证细胞汇合率达9095%（比较高;DNA/ Lipofectamine2000比率1: 0.51:5，一般细胞1:23.脂质体转染法的主要优点是可用将DNA转染至悬浮或者铁壁细胞培养、转染 效率相对较高、对基因片段大小的限制较小等，但是阳离子脂质体对细胞的毒性相对较高，为了防止其毒性，要摸索好如下实验条件: 脂质体与质粒的比例、细胞转染时间等。脂质体是由脂双分子层组成的颗粒，可介导基因穿过细胞膜。通过脂质体介导 比利用病毒转导进行基因转移具有以下明显的优势:脂质体与基因的复合过程 比较容易;易于大量生产;脂质体是非病毒性载体,与细胞膜融合将目的基因导 入细胞后，脂质即被降解,无毒,无免疫原性;DNA或RNA可得到保护,不被灭 活或被核酸酶降解;脂质体携带的基因可能转运至特定部位;体外和体内试 验都表明，接近染色体大小的DNA片段也能被转运至宿主基因组中并增长;转染过程方便易行，重现性好。脂质体是具有双层膜的封闭式粒子，自身聚集性脂类分子包封内水相介质，可分 为大、小多层，寡多层和单室脂质体，医学应用较多为小单室脂质体。基于脂质体 作为药物载体系统的经验，理想的用于转运基因的脂质体，对于质粒DNA具有高包 封率，保护DNA不被血浆核酶降解的特点,它们粒径分布范围窄，粒径平均为100 nm或者更小。为使脂质体接近血管外区域，故采用具有广泛的结合潜力脂类，这种 特殊脂类可促进与细胞膜融合和/或提高脂质体在循环系统中的稳定性。第1种为传统上的脂质体，人们可控制其体外行为，但不能控制其体 内行为，它们很快被灭活或被固定;第2种为无活性脂质体（即不与外界作用，由于 聚合物包封于表面的立体稳定性而抑制其相互作用；第3种脂质体表面结合抗原、 凝集素或其他基团，由于表面结合的特定配基，也可特定地相互作用;第4种为反应活 性脂质体，如离子型、靶敏感型和融合性脂质体，这种脂质体有时指相转变的多孔 脂质体，脂质体内有离子敏感亚基,Ca2+其他金属离子敏感性脂质体，也包括阳 离子脂质体，阴离子脂质体。阴离子脂质体不属于有反应活性类，但特殊的试验 如试管内与相反电荷（多离子相互作用例子除外。常规脂质体进入细胞转运DNA实验,其原理是脂质体增强细胞体的聚集，即加 速大分子、荷电多的分子透过膜，该过程相当复杂，尤其在包封较大片段时，在实践中 这种技术只在体外使用且要用融合剂,荷电越多用途越少。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将 药物送入细胞内部。