动物细胞融合作者:日期:动物细胞融合【实验目的】1 ,了解动物细胞融合的常用方法2 .学习化学融合和电融合的基本操作过程3 .观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化【实验原理】A.细胞融合的方法细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。1 .病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。但该法由于病毒的灭活较为复杂，故实验室多不采用此法用于细胞的融合。2 .化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇（）、二甲基亚碉、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是广泛使用的化学融合剂。3 .电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。B.PEG诱导细胞融合聚乙二醇（PEG）结构为：HCH2C（CH20CH2）nCH2O,为一系列不同相对分子量的多聚体。相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为聚乙二醇分子能与水分子借氢键结合，导致细胞膜由于脱水而膜结构发生改变，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合：细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合的细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。实验室常用分子量为400-6000D的PE训于动物细胞的融合，动物细胞的融合受到很多外界因素的影响，如：PEG的浓度，作用时间，PH等。一般来说，PEG相对分子量越大，融合效果越好，而PEG的浓度通常为40%60%PEG的作用时间通常为：15min,作用温度为：3840C,常使用GKN液将溶液的PH调节至8.08.2。同时GKN夜还可以调节动物细胞的渗透压从而使细胞保持一定的形态。【实验用品】1 .材料鸡血红细胞2 .试齐1J50%PEGGKN夜（NaCl8g,KCl0.4g,N&HPO-2Ho1.77g,NaHPQHO0.69g,葡萄糖2g,酚红0.01g,溶于1000ml双蒸水）、AIscvers细胞保存液、0.85%氯化钠溶液；3 .器材显微镜、离心机、烧杯、载玻片、盖玻片、离心管（带刻度）、液体混合器、胶头滴管、废液缸等。【操作步骤】1 .鸡血红细胞的制备与保存用无菌注射器抽取Alsevers细胞溶液2ml,再从鸡翼下静脉取血2ml,取出后至于离心管中再力口入6m1Alsevers细胞溶液，混匀并封口，至于4c的冰箱中保存。2 .PEG诱导融合1） 取鸡血Iml+4ml0.85%勺NaCl溶液，在1200r/min的离心机内离心5分钟。2）将离心后的溶液，去上清液后，剩余约0.1-0.2ml。在沉降血球中，加入GKNB至4ml,使之成每毫升含血球15000万个，即15x103个/ml。3）取上述1ml加0.5ml60%勺PEG1，先静置使之呈明显的分层3min,然后用液体混合器将液体混匀，停留1-2分钟，即可镜下观察。4）取上述制备的液体约半滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察，观察时注意找不同融合时期的融合细胞进行观察与拍摄。【实验结果】实验结果如下图所示:图4两个细胞完全融合图3两个细胞绝大多数部位发生融合【实验结果分析与注意事项】1 .制备的鸡血红细胞悬液的浓度不宜过高，否则细胞容易聚集，融合效果受影响。浓度可根据集体细胞情况调节。PEG的分子量应为400-6000之间，PEG溶液浓度为40%-60%,融合时间为1-5分钟。若超过以上三个条件，可能超过了细胞膜的自我修复限度，导致细胞膜破损，无法修复；若低于以上三个条件，可能细胞的破损程度较低，不能进行融合。2 .溶液的pH值:8.0-8.2,可采用缓冲液。温度为：38-40C。适当地提高温度可以使细胞融合得更充分，但温度不能过高，以免细胞膜上的蛋白质变性。3 .从试管中提取溶液时，最好使用注射器，不宜污染试管而且容易控制。4 .切记：加入PEG寸,应该先反应后摇匀，否则会导致细胞融合不充分。【思考题】1 .思考细胞融合的理论和实际意义(1) 理论：主要利用了质膜的流动性和自动修复功能。(详细理论见)(2) 实际意义：细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草十郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。【附】细胞融合技术的应用一、动物细胞融合技术动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品。培育动物新品种，缩短动物的育种过程，动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，可别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成就。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但是在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对于研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。1 .用于生产单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。中科院上海细胞生物学研究所研制成功抗北京鸭红细胞和淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体，同时还与有关医学部门合作，成功地制备了抗人肝癌和肺癌的单克隆抗体。，从而可以实现把基因2 .用于基因定位和绘制人类基因图谱杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系定位于某一染色体或某一区段上。3 .用于动物育种体细胞核移植技术是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体。但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术做了良好的铺垫。4 .用于细胞疗法将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，而且也避免宿主对外来物的免疫排斥。5 .动物体细胞融合在基础理论研究方面的作用在这方面，细胞融合主要用于研究细胞核质关系和个体发育，解释疾病的发生机制和膜蛋白动力学研究。二、植物细胞融合技术植物细胞融合技术目前主要是作为扩大变异的手段，同时也朝着将抗药性和胞质雄性不育等细胞基质基因导入另一个体细胞的方向发展，有可能形成新的核质杂种。如果获得了有用性状的细胞系，在还不能形成植株时，就可以通过快速大量繁殖细胞加以利用。1 .在生产研究方面植物细胞融合在育种上有重要的应用价值，在生产研究应用方面，通过诱导不同种属间甚至不同科间原生质体的融合，可能打破有性杂交不亲和性的界限，广泛地组合各种基因型，从而有可能形成有性杂交方法所无法获得的新型杂交植株。2 .运用于外源遗传物质引入原生质体植物细胞融合可以将细胞器、DNA质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体，从而有可能引起细胞遗传性的改变，为某些珍稀动物的复壮等提供了可行的方法，应用于植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产等等。三、微生物细胞融合技术用于植物和微生物育种是细胞融合技术最基本的应用领域，对微生物而言，该技术主要用于改良微生物菌种特性，提高目的产物的产量，使菌种获得新的性状，合成新产物等。1 .微生物细胞融合技术的对象在目前，微生物细胞融合的对象已拓展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间，不断培育出用于各种领域的新菌种。2 .微生物细胞融合技术的应用微生物细胞融合技术的一项突出应用是生物药品的生产，包括抗生素、生物活性物质、疫苗等。它适用于疾病的诊断、预防及治疗等。另一方面的突出应用就是为发酵工业提供优良菌种。在对未来的展望里，细胞融合在细胞遗传学、细胞核质关系、单克隆抗体及远缘杂交育种等方面具有重要价值。