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资源描述
酶活米氏常数实验一、实验前准备 1、24孔板洗净烘干,准备足够枪头。 2、准备催化剂,在光下呈透明状为分散性较好,否则用超声清洗器(位于化学间)超声分散5min,期间准备底物(如TMB或者ABTS),浓度依照自己实验的要求定(10mg/mL或5mg/mL),一般1mL足够用,可在1.5mL离心管中溶解。TMB(外间冰箱上层)溶于DMSO(二甲亚砜,位于化学间王春雨的柜子里),ABTS(与TMB放在一起)溶于二次水。3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200L和10L移液枪、50L排枪(位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中)、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中,放到对面酶标仪前,开空调定室温(25,提醒其他人随手关门),24孔板中其中一排加入适量H2O2(每孔1mL左右,注意避光,可在板上盖一张卷纸),将缓冲液、催化剂、底物放实验台上,静置0.5-1h。4、记录本上提前写好实验的加样顺序: 催化底物TMB(或ABTS)的酶促动力学过程加样顺序:200L缓冲液 10L催化剂 底物TMB(ABTS)(0,0.5,1,2,4,6,8,10L) 32LH2O2(排枪加)催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序:200L缓冲液 10L催化剂 H2O2(2,4,6,8,10,16,32,64L) 10L底物TMB(ABTS)(排枪加) 数据记录按下表记,Code为每次读板时的微孔板编号,Time为对应的读板时的时间,一般30s读板一次,可根据反应的快慢来确定读板的时间。Code1234567TimeTMB00.51246810V01Code1234567TimeH2O2246810163264V01二、实验 1、打开酶标仪(开关在仪器后部,若仪器没反应,请检查电源是否接通),密码为5个0,按Enter键进入系统。电脑开机,密码为mby-nano,双击酶标仪软件图标,出现登录框,直接点击“登录”,进入酶标仪控制界面,若底物为TMB,选择“铁动力学”(波长为650nm),选择模板1;打开电脑内置时钟, 若底物为ABTS,则检验项目选择“gg”(波长为405nm) 。新建一个word文档,以日期命名,打开。 2、加样:96孔板从左至右编号为1-12,自上而下编号为A-H。以TMB为例,从第1列加样:从A1至H1,每孔加200L NaAc/HAc Buf;从A1至H1,每孔加10L催化剂(每加一个孔,换一次枪头,加样时用枪头搅匀反应体系);从A1至H1,每孔分别加不同体积(0,0.5,1,2,4,6,8,10L)TMB(每加一个孔,换一次枪头,加样时用枪头搅匀反应体系);用排枪吸取32L H2O2加入A1至H1,快速放入酶标仪中,点击“读板”,记下读板时间(如下表所示,假设第一次读板时间为09:00:00)Code1234567Time00:0000:3001:0001:3002:0002:3003:0003:30TMB00.51246810V01用排枪加H2O2时,注意检查枪头是否插紧,否则会导致吸取H2O2的量不足。亦可先将96孔板放入酶标仪,再加H2O2,这样可以节约时间。每次读板出来结果后,点击“结果入库”“是”“确定”,按下“PrintScreen”键,点击“退出”,打开word文档,ctrl+V或者右击选“粘贴”,保存结果,要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存,可点击“查询结果”,下拉框中选择目的模板编号即可。(现已可以直接拷吸光值读取数据,按ctrl键点击该处文字见方法)3、第一组数据保存后,将第一组的反应液倒掉,用卷纸将边上的液体擦干。第二、三、四组同第一组的操作。保存所有数据,拷贝到U盘里,整理实验台,关掉酶标仪、空调和电脑。4、若当天不再继续实验,将24孔板中剩余的H2O2倒掉,用清洁剂洗后,再用二次水冲洗一次,放入烘箱中烘干。移液枪放回原处,催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。三、数据处理 1、打开Origin6.1,点击右上角的“Add New Column”(箭头所指):,亦可右击 Add New Column。 2、输入数据:命名各列,X列命名为时间,单位s,8个Y列分别为8个孔的编号。X列时间从0-180s,0 s对应微孔板编号1的数据,30 s对应code2的数据,以此类推,将所读数据输入。 点击“file”“Save Project As”,保存文件名为“第一组”。 3、数据输入完成后,选择X和Y列,点击左下角的“点图”标志(箭头所指)作出点图,点击AnalysisFit Linear作线性拟合,在结果对话框里,拟合的方程为Y=A+B*X,B的值为拟合得出的斜率即反应的初速度V, 同样方法得出不同TMB体积对应的反应初速度V,记录数据:Code1234567Time00:0000:3001:0001:3002:0002:3003:0003:30TMB00.51246810V0100.007140.009020.011620.014250.015970.015470.017 同样方法得出第二、三、四组的反应初速度V,记录数据。4、新建New Project,数据表1中命名X列为底物(TMB)浓度,列中数据为A-H对应的孔中TMB的物质的量浓度(一般用moL/L);挑选三组比较好的初速度V,输入Y列。选中初速度V的三列,右击Statistics on Rows,得出数据表2,选定Mean和sd列中的值,右击复制,粘贴至数据表1中,选定sd列,右击Set AsY Error,将标准方差设为误差棒。选定X列、Mean列和sd列,画点图,点击AnalysisNon-linear Curve Fit,作非线性拟合拟合的方程为米氏方程y=P1*x/(P2+x),y为反应初速度,x为底物浓度,P1为Vmax值,P2为米氏常数Km值(若软件中没有此方程,可点击New新建方程,之后也可点击Edit编辑方程);点击Start Fiting,得出对话框,点击Active Dataset,设定P1、P2初始值为1,点击10lter进行非线性拟合,得出,记录Vmax和Km值。可双击X或Y轴修改坐标轴名称,点击图上方的“T”标志可在图上插入文本框,将Km和Vmax值写入。5、保存结果。6、计算Kcat值Kcat表示每个酶分子在单位时间内催化底物的分子数,反应了酶催化能力的大小。根据下面的公式计算: (1) (2) (3)v的单位为Ms-1;vmax为非线性拟合得出的值,单位为s-1;=39000M-1cm-1;l为反应体系的高度,96孔板每个孔的高度为1cm,每个孔的容积为300L,可根据反应体系的平均体积占300L的比例来计算反应体系的高度;E为催化剂的浓度,单位为M;m为催化剂的质量,可根据加入催化剂的体积和催化剂溶液的浓度计算得出;r为催化剂粒子的半径,以透射电镜测出的粒径计;为催化剂的密度,单位为g/cm-3;NA为阿伏伽德罗常数,值为6.021023;V为反应体系的平均体积;Kcat单位为s-1。附:直接拷数据方法:1. 每次读板后,数据结果入库,待全面测完,按照当天的日期在桌面的DATA文件夹中查找自己的数据,格式为记事本,如20100825.txt,该文件拷入自带u盘。2. 选中该记事本文件,右击打开方式,选择用写字板打开,如图打开后如下:3. 按ctrl+A,将写字板文件中全面数据选中,复制,新建一个word文档,粘贴。4. 选中某一列数据:先将鼠标指针放在该列数据的第一个数据前面,然后按住alt键,向右下方拖动,直到黑色黑色区域将该列数据全面覆盖,注意不要覆盖其他数据,如图:5. 选中之后先松开鼠标,再松开alt键,选中后不要点击鼠标(左右键都不要点),按ctrl+c 复制该列数据。6. 打开origin软件,选中某列,按ctrl+v 即可将该列数据拷入选中列,如图:7. 友情提示:在直接拷取数据时,如遇到不能直接拷入origin中时,可在word中插入表格,选中表格中一行或一列,将从txt中复制的数据粘贴进去,再在表格中重新选中数据,复制,即可一一对应的拷入origin中的表格中。8. 后续步骤按以上操作指示进行(按ctrl键点击该处)
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