比浊法快速测定硫酸多黏菌素 E效价作者：佟斌 吴兆亮殷昊赵艳丽【摘要】 研究比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律，建 立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速测定 方法，检测时间由杯碟法的20h缩短 到4h。当硫酸多黏菌素E的效价为30100u/ml时，检测菌液接种浓度为5% 培养时间为4h,吸光度对数值与抗生素效价具有良好的线性关系。本法重现性 好，相对误差小于5%【关键词】硫酸多黏菌素E比浊法效价Fast determ in atio n of the pote ncy of polymyxin E by turbidimetry assayABSTRACT A turbidimetry assay for fast determ in ati on of polymyxin E pote ncy was developed by study ing on the in flue ncing factors.Compared with Oxford assay, turbidimetry assay decreased the determ in ati on time from 20 hours to 4 hours.The re was a lin earrelatio nship betwee n the pote ncy of polymyxin E and the logarithm of absorbe ncy in the range of 30100u/ml and ino culati ng concen trati onwas 5%, with 4 hour culture time. The turbidimetry assay had a good reproducibility, and the relative error was less tha n 5%.KEY WORDS Polymyxin E; Turbidimetry assay; Pote ncy 多黏菌素E(polymyxin E或colistin) 是由多黏芽抱杆菌抗敌素变株(Bacillus polymyxin var.colistinus)经发酵培养生产的一种环状多肽类抗生素，它对革兰阴性杆菌有强烈的抑菌作用1。由于多黏菌素E具有高效、低毒、残 留少的特性，将其硫酸盐制成兽药用于防治由大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙 门菌等革兰阴性菌2引起的肉鸡、猪、牛等畜禽的肠道疾病。目前采用杯碟法3, 4测定其生物效价。杯碟法操作步骤复杂，耗时长，测定时间需要 大约20h，不能快速反馈工业生产中各个阶段产品生物活性，必须开发一种 快速测定硫酸多黏菌素E效价的方法。比浊法是抗生素效价微生物检定的方法 之一58，其原理是将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养 基内，混匀后，经短期培养，测量培养物的吸光度，在一定线性范围内细菌培 养物吸光度的对数值logA与抗生素的浓度成正比，比浊法具有检测快速的特 点。本文深入研究了比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律，建立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速检测方法。1材料与方法1.1材料检定菌 大肠埃希菌(CMCC44102购自微生物菌种保藏中心。(2) 硫酸黏杆菌E素(硫酸多黏菌素E)标准品 中国兽医药品监查所提供， 批号 K02700902,效价 19536u/mg。(3) 主要仪器752紫外分光光度计；恒温水浴振荡器；牛津杯(不锈钢，高 100mm 外径 8.0mm 内径 6.0mm); PHS 3C精密 pH计。1.2方法(1) 检定培养基的制备 称取蛋白胨8g，牛肉膏4g，酵母粉5g，磷酸氢二钾3.3g，磷酸二氢钾1g,氯化钠4.5g，葡萄糖2.5g，加蒸馏水至1000ml加热混 匀，调节pH值为7.2，过滤，115C灭菌30min。(2) 检测菌液的制备取大肠埃希菌的琼脂斜面培养物一支，加0.9%灭菌生理盐水1ml洗下菌苔转入茄瓶，37C培养1822h，用0.9%灭菌生理盐水15ml洗下 菌苔，制成菌液，在分光光度计上波长为600nm处用0.9%灭菌生理盐水调节菌液吸光度值(A=2左右)，用此菌液分以2.5%、5%0 10%勺接种量接种至检定培 养基作为检测菌液。(3) 硫酸多黏菌素E标准溶液的配制 精确称取硫酸多黏菌素E标准品，用 pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释到600u/ml，再用水稀释成浓度分别为30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8种浓度的标准溶液。(4) 比浊法吸光度测定 精密吸取1ml硫酸多黏菌素E溶液，加9ml检测菌液， 放入恒温水浴摇床以200r/min转速37C振荡培养一定时间，取出，立即用冷 水冷却，摇匀，以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比，用分光光度 计在600nm波长处9分别测定吸光度。(5) 比浊法样品检测 将样品稀释到适当浓度后，按实验1.2.(4)中有关步骤操作测定吸光度，在吸光度对数效价标准曲线上查对应的效价，乘以稀释倍数，即得到样品的效价。2结果与讨论2.1检测条件的选择(1) 大肠埃希菌生长曲线的测定 将大肠埃希菌菌液分别以2.5%、5.0%和10%勺 接种量接入检定培养基，37r条件下以200r/min振荡培养，在600nm处每小时 检测一次培养物的吸光度，结果如 Fig.1所示。大肠埃希菌在 自然 状态下生 长时延迟期一般为1h左右，这一时期菌体生长缓慢，菌量基本上维持在最低水 平；然后进入指数期，这一时期大约持续78h,这一时期菌体生长速率常数最大，生长最迅速；9h以后进入稳定期，菌体总量保持不变。当菌体生长时间 在24h,吸光度值达到0.41.0，处于最佳检测时期。Inn oculati ng con ce ntrati on: 1: 2.5%; 2: 5%; 3: 10%Fig.1 Cell growth curve of E.coli (2)检测菌液接种浓度的选择 将接种浓度分别为2.5%、5.0%和10%勺检测菌液按实验1.2. 培养2h，绘制吸光度 效价曲线(Fig.2)。由Fig.2可见，不同接种浓度的检测菌液对培养物的吸光 度影响较大。当检测菌液接种浓度为2.5%时，由于初始接种量少，少量抗生素的存在能够完全抑制菌体的生长，菌体几乎不能生长；当检测菌液接种浓度为 10%寸，菌体生长很快，抗生素难以抑制菌体生长，不同浓度抗生素对菌体生长 的抑制程度不明显；当检测菌液接种浓度为5%寸，不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度区别明显，灵敏度高，因此5%接种浓度的检测菌液适合本法测定硫酸多黏菌素E效价。Inn oculati ng con ce ntrati on: 1: 2.5%; 2: 5%; 3: 10%Fig.2 Effect of differe nt inno culati ng concen trati onon absorbe ncy(3)培养时间的选择 接种浓度5.0%的检测菌液，按实验1.2.(4)分别培养2、3 和4h，绘制吸光度 效价曲线(Fig.3)。由Fig.3可见，在实验菌接种量固定 在5%勺条件下，增加培养时间，灵敏度提高显著。培养时间为2h,吸光度 效价曲线比较平坦，灵敏度低，当培养时间增加为4h,不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度区别明显，灵敏度高，因此选择4h作为培养时间用于检测。2.2标准曲线的确立精密吸取30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8种硫酸多黏菌素E标准溶液各1ml,加9ml接种浓度为5%勺检测菌液，放入恒温水浴摇床以转速 200r/min 37 C培养4h,取出，立即用冷水冷却，摇匀，以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比，用分光光度计在 600nm波长处分别测定吸光度， 以硫酸多黏菌素E浓度为横坐标，吸光度对数值为纵坐标，绘制标准曲线(Fig.4) o将吸光度对数值对相应浓度进行线性回归，得到回归方程：lgA=-0.01039C+0.1837 r=0.9953可见硫酸多黏菌素E的浓度在30100u/ml的范围内与吸光度对数值呈良好的 线性关系。2.3重现性测定用比浊法对3个不同规格的硫酸多黏菌素 E样品进行重现性试验，检测4次结 果见Tab.1，相对标准偏差在3%以内，重现性较好。2.4正确性测定以杯碟法10测定效价数据为标准，得出本方法 的准确度(Tab.2);比浊法测定的相对误差在5鸠内，符合药典规定要求，提示比浊法能够准确测定硫酸 多黏菌素E效价。3结论(1) 比浊法能够快速、准确地测定硫酸多黏菌素E效价，检测时间由杯碟法的20h缩短到4h，方法重现性好，相对误差小于 5%(2) 比浊法进行硫酸多黏菌素E效价测定时应注意培养基的质量以及检测仪器等。培养基配置后应过滤后再灭菌，以免培养基中形成沉淀影响 测量。试管应选同一批、同一型号，管壁均匀一致，试管洁净无污染，以免影响测量结 果。培养结束后立即冷却，测定前应摇匀。【参考 文献】1 Starkey D D, Antoinette I, Ralph J W. Paradoxical synergism andan tago nism betwee n serum and an tibacterial activity of colisti nJ . J Infect Dis,1971,23(4):3922 Jian L, Roger L N, Robert W M, et al. Evaluation of colistin asan age nt aga inst multiresista nt Gramn egative bacteria J .Int J An timicrob Age nts,2005,(25):113 吴佩玲.改进硫酸粘杆菌素含量测定方法的介绍J . 中国 兽药杂 志，1990，3: 224 张纯平，肖希龙.硫酸粘杆菌素微生物检定法的改进J.中国兽药杂志，2002，36：335 杨亚莉，胡昌勤.中国药典2005年版微生物检定法的增修订情况及要点J.中国抗生素杂志，2005，30(12) : 707 6TheEuropean Pharmacopoeia Commission. The EuropeanPharmacopoeiaS. 5ed.Brussels: Council of Europe,20027 张治锬. 抗生素药品检验 M. 北京：人民卫生出版社 ,1987 ：808 朱会琴，逢涣欢，胡昌勤，等 . 浊度法测定两性霉素 B 及其脂质体的效价J 中国抗生素杂志，2005, 30（12） : 7529 沈萍，范秀容，李广武 . 微生物学实验 （第三版） M . 北京：高等 教 育 出版社， 1999: 9710 国家药典委员会中华人民共和国药典2005年版（二部）S.北京: 化学 工业 出版社， 2005:附录 XIA