马铃薯腐烂茎线虫 2-Cys Prx 和 Gpx 基因的原核表达及2-CysprX卬制剂高通量离体筛选体系的建立全球农作物每年由植物寄生线虫引起的产量损失就高达1250 亿美元。目前防治线虫的方法主要是通过栽培技术、作物轮作、抗性品种的选择, 结合使用一些现在仍批准使用的化学杀线虫剂。虽然这些化学药剂对线虫防治起到了积极作用 , 但我国现有防治线虫病害的药剂品种少, 可供选择性不强, 有关杀线虫剂的研究和开发 , 无论是理论研究和技术开发上 , 都还是农药领域中非常薄弱的部分。开发新型、低毒、高效杀线虫剂成为必然趋势。植物线虫抗氧化系统机制的深入研究为药物靶点的开发和利用提供了理论依据和新的切入点。 1. 本文采用马铃薯腐烂茎线虫 (Ditylenchus destructor)为研究对象，将谷胱甘肽过氧化物酶基因(DdGpx)克隆到pET-41b载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,并对其表达条件进行了 IPTG浓度优化和温度优化。结果显示,SDS-PAG斑胶电泳在60 kD处有一条明显的带。经质谱鉴定，此 条带有7个肽段与马铃薯腐烂茎线虫 GPXS配。表明重组Dd-GPXg白表达成功。IPTG浓度对其表达量无明显影响，但温度 影响明显，当温度在18c时，重组Dd-GP滥白基本以可溶性形式表达，25C时，表 达部分可溶性蛋白 ,37 时 , 全部以包涵体形式表达。2.将马铃薯腐烂茎线虫2-Cys Prx基因(DdPrx)克隆到pET-41b载体在大肠 杆菌BL21(DE3)中进行原核表达，并对其表达条件进行了 IPTG浓度优化和温度优 化。结果显示，SDS-PAG斑胶电泳在55 kD处有一条明显的带。经质谱鉴定，此条带有2个肽段与马铃薯腐烂茎线虫PRXS配。表明重组Dd-PRX蛋白表达成功。IPTG浓度对其表达量无明显影响，但温度影响明显，温度为18c和25 c时， 重组Dd-PRX蛋白基本以可溶性形式表达，37 C时，表达部分可溶性蛋白。3.对重 组马铃薯腐烂茎线虫2-Cys PRX白，采用硫氟酸铁法进行了酶动力学分析，优化 并建立2-Cys PRX 抑制剂的高通量离体筛选体系。酶动力学分析结果表明，重组DdPrx蛋白不仅对H202具有较高的亲和力，也 具有很强的清除H202能力。其米氏常数，催化常数及催化效率分别为22.25以 mol/L,1315.41s-1 及 5.91 义 107。4. 采用对 Prx 具有抑制活性的 1,4- 二氧代 -2,3- 二溴甲基喹啉（Conoidin A）对筛选体系进行了离体、活体测试。结果显示：Conoidin A浓度在11.25仙mol/L 180仙mol/L对重组Dd.PRXS白的抑制率为22%-41%非Prx抑制剂2,3-双（澳甲 基）唾喔咻浓度在11.25 mol/L180仙mol/L对重组Dd-PRX蛋白的抑制率为 9%-29%两者间抑制效果差异明显；活体测试结果表明,Conoidin A 对水稻根结线虫的抑制效果表现出随浓度提高抑制效果增加的趋势，其中药后6天,50小mol/L Conoidin A对水稻根结线虫的抑制效果达 64.8%,药后12天则对水稻根结 线虫的抑制率下降到29.0%,而药后6天对照药剂 2,3- 双（溴甲基 ） 喹啉对水稻根结线虫的抑制效果仅为 33.0%,药后 12天则下降为 4.7%, 明显低于同等剂量 Conoidin A 的效果。综上所述 , 本研究构建了 pET-41b-Prx 和 pET-41b-Gpx 表达质粒 , 建立了在 大肠杆菌中制备、纯化 2-Cys PRX 蛋白的方法, 建立了以 2-Cys PRX 为靶点的体外高通量筛选体系 , 可用于抗植物线虫侵染之抑制剂的筛选, 为进一步开发新型杀线虫剂奠定了基础。