绵阳师范学院本科生毕业论文 题 目 芦丁与牛血清白蛋白的相互作用研究 专 业 化 学/应用化学 院 部 化学与化学工程学院 学 号 0610410160 姓 名 指 导 教 师 讲 师 答 辩 时 间 二一三年五月 论文工作时间：2012年12月 至2013年5月论文题目来源：国家自然科学基金项目编号： 四川省自然科学研究项目编号： 校级自然科学研究项目编号： 绵阳师范学院2012届本科毕业论文 芦丁与牛血清白蛋白的相互作用研究学 生 指导教师 摘 要：为了探究黄酮类化合物与蛋白分子的作用方式，本文用荧光光谱技术研究了水溶液中芦丁与牛血清白蛋白的相互作用。结果表明，芦丁与牛血清白蛋白分子在290 K、298 K时结合常数Ka分别为4.384103 Lmol-1、0.7032103 Lmol-1，根据热力学参数确定其作用力以范德华力或氢键作用力为主。另外，获得了芦丁对牛血清白蛋白在波长345 nm内源荧光下产生较强的荧光猝灭作用，并根据其不同温度下猝灭作用数据参数得出其机理为静态猝灭机制。关键词：芦丁；牛血清白蛋白；相互作用；荧光光谱Study on the binding interaction between rutin and BSA Undergraduate Supervisor Abstract：The interaction of rutin and bovine serum albumin (BSA) in aqueous solution (Tris-HCl buffer, pH=7.4) has been studied by fluorescence spectrometry. The results showed that the fluorescence intensity of BSA at 345 nm was quenched intensively by rutin. According to the quenching effect of rutin on the fluorescence intensity of BSA under different temperatures, and the quenching mechanism was confirmed to be a static one. The binding constants Ka at 290 K and 298 K were 4.384103 Lmol-1and 0.7032103 Lmol-1. Based on the thermodynamic parameters, the electrostatic action was confirmed to be Vander walls force or bond. Keywords：Rutin; Bovine serum albumin; Fluorescence spectroscopy2 罗 涛 绵阳师范学院2012届本科毕业论文 目 录前言/引言11 芦丁和牛血清白蛋白的研究现状11.1 芦丁11.1.1 抗自由基活性11.2.2 抗脂质过氧化作用21.2.3 血管舒张作用21.2.4 抗病毒作用21.2.5 拮抗血小板活化因子作用31.2.6 抗急性胰腺炎(AP）31.2.7 对胃溃疡的保护作用41.2 牛血清白蛋白41.3 本研究目的、意义和主要内容41.3.1 本研究的主要内容41.3.2 本研究意义51.3.3 创新点52 实验原理与理论方法52.1 牛血清蛋白检测原理52.2 荧光检测原理53 实验部分73.1 仪器73.2 试剂73.3 标准溶液配制83.3.1 NaCl水溶液83.3.2 牛血清白蛋白溶液83.3.3 Tris-HCl缓冲溶液配制83.3.4 牛血清白蛋白溶液体系的配制83.4 荧光测量82.4.1 室温（290 K）下测量82.4.2 298 K下测量94 结果与讨论94.1.1 基础理论94.1.2 温度的影响104.1.3 药物分子与蛋白质分子间结合力的确定125 结论13参考文献14致 谢16前言/引言研究背景1 芦丁和牛血清白蛋白的研究现状1.1 芦丁 芦丁(见图1-1)又名芸香苷、紫槲皮苷，为一来源很广的黄酮类化合物。主要存在于豆科植物槐的花蕾（槐米）、果实（槐角），芸香科植物芸香全草，金丝桃科植物红旱莲全草及蓼科植物荞麦的籽苗中1。图1-1 芦丁的结构式图自发现芦丁化合物以来，人们对芦丁进行了多种方面的研究，其主要功能表现在如下几个方面：1.1.1 抗自由基活性芦丁为黄酮类化合物，是清除自由基的强氧化剂，它可终止自由基的连锁反应，抑制生物膜上多种不饱合脂肪酸的过氧化作用，清除脂质过氧化产物，起到保护生物膜的药理作用2。姜宝红等3考察了体外具有较强醛糖还原酶活性的芦丁对大鼠糖尿病肾病（ND）的防治作用，结论提示芦丁可改善四氧嘧啶大鼠糖尿病肾病，其机制可能与抑制醛糖还原酶和消除氧自由基有关。芦丁在体外具有自由基清除（在10-2 molL-1时的抑制率达到31.4%）和抑制醛糖还原酶活性（在10-2 molL-1所有数字和单位之间空一格时的抑制率达到74.2%）的作用，从而阻止葡萄糖转变为山梨醇，减弱山梨醇通路激活对大鼠造成的损害。另外，芦丁可降低肾组织脂质过氧化物酶（LPO）活性，延缓氧自由基对肌体的进一步损伤。陈仙等4探讨了芦丁是否对高能冲击波引起的肾功能损伤有保护作用。有学者认为体外冲击波碎石术除产生机械作用外。还可能对肾组织细胞产生生物化学作用，这种作用的基础是氧自由基。氧自由基的产生参与了体外冲击波碎石术后肾功能损害。有资料证实，芦丁具有阻止氧自由基所致的脂质过氧化作用及稳定细胞膜、抑制细胞膜系统内钙离子水平的异常升高，并通过舒张血管平滑肌而改善肾脏有效血浆流量（ERPF），增加肾小球滤过率。实验证实在体外冲击波碎石术前应用芸香苷，则体外冲击波碎石术后血丙二醛（MDA）含量较对照组患者明显降低，血超氧化物歧化酶（SOD）活性较对照组明显升高，提示芦丁可使氧自由基减少，SOD活性上升。因此，芦丁通过上述药理作用发挥效应，减轻高能冲击波对肾组织细胞的损害，有效地防治体外冲击波碎石术所致的肾脏损伤。研究表明，脑在缺血低氧时有大量的一氧化氮（NO）及自由基产生，这可能与脑细胞的凋亡有关，如对脑缺血损伤有一定的保护作用，其保护作用可能与其抗自由基作用、抗凋亡及减少NO生成有关。1.2.2 抗脂质过氧化作用脂质过氧化是指活性氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而引起的一系列氧化过程。朱建林等5通过对大鼠SOD活性、自由基脂质过氧化产物MDA含量及大肝脏脂褐（Lipofuscin）含量的测定及分析发现，芦丁对去势大鼠脂质过氧化有抑制作用，可抑制去势后大鼠抗氧化系统抗氧化能力的下降。芦丁具有对抗内源性雌激素下降引起的抗氧化能力的下降，具有抗氧化作用。高密度脂蛋白（HDL）具有抗动脉粥样硬化作用。但HDL与低密度脂蛋白（LDL）及极低密度脂蛋白（VLDL）一样在体外也可被氧化修饰，一旦HDL被氧化修饰则具有致动脉粥样硬化作用。孟芳等6利用体外Cu2+介导氧化修饰的手段，探讨了芦丁对HDL氧化修饰作用的影响。结论表明芦丁可显著抑制HDL的氧化修饰。1.2.3 血管舒张作用 实验检测芦丁对去氧肾上腺素（phenylephrine，PE）预收缩的胸主动脉环张力的影响，表明芦丁可能通过NO鸟苷酸环化酶途径产生内皮依赖性的血管舒张作用7。1.2.4 抗病毒作用 有研究表明，芦丁有抗病毒和抑制醛糖还原酶活性的作用。实验发现，芦丁的肺指数抑制率27.1%27.3%只有“%”符号前不空格，能够降低流感小鼠的肺指数，具有明显的抗流感病毒的作用，并与有关芦丁能够使毛细血管的脆性及异常的通透性得到改善的报道相一致8-9。1.2.5 拮抗血小板活化因子作用血栓形成、动脉粥样硬化、炎症反应及缺血再灌注自由基损伤等诸多心脑血管疾病的发病过程均与血小板活化因子（PAF）介导密切相关，因此拮抗PAF的作用，为目前缓解缺血性心脑血管疾病的重要途径。实验表明，芦丁可拮抗PAF与兔血小板膜受体的特异性结合，抑制PAF介导兔血小板黏附与PMNS内游离Ca2+浓度升高，表明芦丁抗PAF的作用机制是通过抑制PAF受体活化，进而阻断PAF诱发的反应，从而起到保护心血管的作用，结果表明芦丁为一种PAF受体拮抗药10。1.2.6 抗急性胰腺炎(AP）芦丁能有效防止低钙血症的发生，并降低胰腺组织Ca2+浓度。研究发现芦丁能提高胰腺组织大鼠磷脂酶A2（PLA2）含量，提示芦丁可能对胰腺组织PLA2的释放及激活具有抑制作用；芦丁能有效防止AP大鼠低钙血症的发生，可能是通过阻止Ca2+内流并降低胰腺组织细胞Ca2+超载，而减轻对AP的病理生理损害11。赵维中等采用放射免疫分析法测定经注射芦丁的模型大鼠血浆血栓素B2（TXB2）、前列腺环素（PG12）及内皮素含量变化。结果芦丁皮下注射给药能有效降低AP大鼠血清淀粉酶含量，改善胰腺组织的病理学变化。与SO组比较，AP模型组造模后12 h血浆的T/P比值较SO组均显著性升高（P0.01）；芦丁各用药组的T/P比值较AP模型组显著性降低（P0.01）。芦丁抗实验性AP作用机制可能与降低血浆T/P比值，改善胰腺微循环障碍有关。陈爱华等12观察各组Wistar大鼠血液流变学、酶学及胰腺的病理学改变，并对胰腺病理切片进行评分比较。结果AP大鼠全血黏度、血浆黏度、血沉、红细胞比容、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数均显著升高，病理检查显示胰腺组织明显坏死和炎性细胞浸润。芦丁（120、60、30 mgkg-1该类单位前空1格）皮下注射给药，可改善上述各项病理生理指标，结果显